29例慢性淋巴细胞白血病Ki-67和Bcl-2的表达及临床意义

　　作者：徐卫,李建勇,吴雨洁,盛瑞兰,陆风翔　　作者单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029

　　【摘要】为了观察Ki-67抗原和抗凋亡蛋白Bcl-2在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的表达，探讨其与CLL疾病分期和预后的关系，用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(SAP)免疫组织化学染色的方法，对29例CLL患者的骨髓或外周血的增殖相关抗原Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl-2进行检测。结果显示： Ki-67抗原在晚期CLL中的表达较早期CLL中的表达高，且差异有显著性;Bcl-2蛋白在晚期CLL中的表达也高于早期CLL中的表达，但差异无显著性;高Ki-67表达组的活存期比低表达组的活存期短，且有显著性差异，而Bcl-2的表达在两组之间无差异。结论：对CLL患者进行增殖相关抗原Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl-2的检测，其结果能反映患者肿瘤细胞的增殖活性和凋亡受抑的情况;Ki-67与CLL疾病分期和预后密切相关。

　　【关键词】 慢性淋巴细胞白血病

　　Abstract To investigate the expressions of proliferative antigen Ki-67 and apoptosis-antagonizing protein Bcl-2 in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and their clinical significance，immunohistochemistry method was used for detection of Ki-67 and Bcl-2 in bone marrow or peripheral blood of 29 patients with CLL . The results showed that the level of Ki-67 expression in advanced stage of CLL was higher than that in early stage of CLL and there was significant difference between these stages of CLL，but there was no significant difference between expression levels of Bcl-2 in two stages. The survival time in the group with Ki-67 expression ≤8% was longer than that in the group of Ki-67>8%，and there was no significant difference of survival time between high and low groups in terms of Bcl-2 expression. It is concluded that detection of Ki-67 antigen and Bcl-2 protein for CLL patients can reflect the status of proliferation activity and apoptosis suppression of leukemia cells in patients; the level of Ki-67 expression closely correlate with the Binet stage and prognosis of CLL.

　　Key words Chronic lymphoblastic leukemia; Ki-67 antigen; Bcl-2 protein; Immunohistochemistry

　　肿瘤的发生，一方面与调控细胞增殖基因的过度表达及分化调控紊乱有关，另一方面也与细胞凋亡基因的调控异常有关。慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种恶性淋巴增殖性疾病，其预后主要与疾病的分期、骨髓浸润的组织特点、外周血淋巴细胞绝对计数、淋巴细胞倍增时间和分子遗传学改变等有关。CLL细胞的过度增殖和凋亡受抑与CLL的治疗和预后也密切相关。Ki-67抗原为一种细胞核抗原，仅在增殖细胞核中表达[1]，其单克隆抗体被认为是较理想的检测细胞增殖活性的抗体。Bcl-2作为一种重要的凋亡拮抗基因[2]，其蛋白产物与淋巴造血系统肿瘤的临床特性和预后有密切的关系。我们采集29例CLL患者的骨髓或外周血，用免疫组织化学染色的方法检测Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的表达水平，了解CLL白血病细胞的增殖与凋亡情况，进行预后分析。

　　材料和方法

　　研究对象

　　29例患者均为在我院初诊的B细胞慢性淋巴细胞

　　白血病(B-CLL)患者，其中男性21例，女性8例，年龄45-85岁，中位年龄64岁。所有病例的临床表现、血象和骨髓象均符合B-CLL的诊断标准[3]。根据CLL国际会议推荐的Binet分期方法[4]进行了临床分期： A期9例(31.0%)、B期12例(41.4%)、C期8例(27.6%)。Ki-67阳性对照为K562细胞株，Bcl-2阳性对照为HL-60细胞株。

　　治疗方法

　　29例均采用口服瘤可然治疗，其中11例口服过环磷酰胺，7例采用COP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)方案联合化疗。

　　测定方法

　　化疗前采集患者的骨髓或外周血(幼稚细胞比例≥0.50)，分离单个核细胞，用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(SAP)免疫组织化学染色方法检测。第一抗体鼠抗人Ki-67单克隆抗体(MIB-1，Immunotech)和Bcl-2单克隆抗体(Bcl-2-124，Dako)各30 μl，37℃，45分钟;生物素标记的第二抗体30 μl，37℃，15分钟;链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶溶液的第三抗体30 μl，37℃，15分钟;碱性磷酸酶底物显色，37℃，15分钟(以上各步均在湿盒中进行)，自来水冲洗，苏木素复染。

　　计数方法

　　油镜下随机计数200个肿瘤细胞，计算Ki-67阳性细胞指数(Ki-67LI)和Bcl-2阳性细胞指数(Bcl-2LI)。

　　统计学分析

　　采用q检验，Kaplan-Meier生存曲线和Log-Rank检验作生存时间分析。

　　结果

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白在CLL中的表达

　　在高倍视野下，Ki-67阳性细胞为核染成红色，多以核仁染色强烈，Bcl-2阳性细胞为胞浆出现红色颗粒(图1、图2)。全部病例Ki-67阳性率在0%-16.0%之间，平均Ki-67LI为(7.24±4.46)%;Bcl-2阳性率在2.0%-91.0%之间，平均Bcl-2LI为(39.52±31.27)%。

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的表达与患者一般情况的关系

　　CLL细胞Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的表达与患者性别、外周血淋巴细胞计数及骨髓淋巴细胞数无相关性。

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白阳性细胞指数与疾病分期(Binet分期)的关系

　　结果详见表1。各组间两两比较，q检验，Ki-67LI q值分别为qA-C 9.15，qA-B 5.54，qB-C 4.35，P值均<0.01，有显著差异;Bcl-2LI q值分别为qA-C 2.80，qA-B 0.90，qB-C 2.11，P值均>0.05。此结果表明，Ki-67LI与CLL的疾病分期密切相关，早期的Ki-67LI低，而晚期的Ki-67LI高。Bcl-2LI与CLL的疾病分期无相关性。Table 1. Ki-67LI(%) and Bcl-2LI(%) in B-CLL at different Binet stages (略)

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白表达阳性率与B-CLL生存期的关系

　　结果详见表2。本组随访时间18-48个月，中位随访时间32个月，其中5例分别于18、26、28、29、32个月死亡。以Ki-67LI的8%及Bcl-2LI的40%为界将患者分别分为2组，用Kaplan-Meier活存曲线分析这2组患者的预后，结果见图3、图4。经Log-Rank显著性检验，Ki-67LI≤8%与Ki-67LI>8%两组的活存时间差异有显著性(P<0.05)。这表明Ki-67LI与CLL的生存时间密切相关，Ki-67LI低的，活存时间长，Ki-67LI高的，活存时间短。而Bcl-2LI≤40%与Bcl-2LI>40%两组之间差异无显著性(P>0.05)。Table 2. Survival time in different groups of B-CLL with Ki-67 and Bcl-2 expression(略)

　　讨论

　　Ki-67抗原是一种人类增殖细胞核抗原，在G1中期到晚期出现，S期和G2期逐渐增加，M期达到最高值，M期后迅速降解或丢失抗原决定簇。现已知道G0期细胞无Ki-67抗原表达;G1期细胞Ki-67抗原仅在核仁周围区域;S期细胞除在核仁周围区域外，核浆内呈均匀着色;G2期细胞核浆内有许多小颗粒形成或呈网状分布;M期细胞Ki-67抗原包裹染色体，并随着核膜消失，整个胞浆也被着色;M期后期Ki-67抗原很快消失。根据Ki-67抗原在细胞中表达与分布的特点，可确定细胞处在增殖周期中的时相。Ki-67单克隆抗体因生长在培养板的第67孔而得名，因其半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速降解，检测结果的可靠性明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原(PCNA )，Ki-67单克隆抗体可标记G1后期，S期，G2期和M期细胞核抗原，而G0期和G1早期的细胞核不被标记，能较全面地反映增殖细胞的数量，因此被认为是较理想的反映肿瘤细胞增殖活性的指标。

　　细胞凋亡是正常细胞的生理特征之一，在细胞的发育、分化、成熟、死亡等过程中起着重要的作用，在肿瘤的发生、细胞损伤反应、信息传递、细胞选择性分化以及抗肿瘤药物治疗等方面也有着重要的意义，细胞凋亡调控的紊乱是肿瘤形成和发展的重要原因之一。对CLL细胞凋亡调控基因的研究在探讨白血病发病机制、提高化疗效果以及寻求新的治疗途径等方面均有重要意义。bcl-2基因是最早发现的细胞凋亡和抑制基因。Bcl-2蛋白的功能是抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，增加细胞对各种凋亡刺激因素的抗性，但不影响细胞的分裂与增殖。Bcl-2 蛋白在一些肿瘤组织中有高表达，这种高表达使肿瘤细胞能抵抗化疗药物的攻击，通过测定肿瘤细胞Bcl-2的表达，可以了解肿瘤细胞因Bcl-2高表达所致的凋亡受阻情况。

　　我们通过对增殖相关抗原Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl-2的同时检测，来研究CLL中细胞的增殖和凋亡相伴情况及其与疾病分期和预后的关系。结果显示，两者与患者性别、外周血淋巴细胞计数及骨髓淋巴细胞数无相关性。Binet分期A期、B期和C期之间Ki-67LI差异均有显著性。分期早的(A和B期)，Ki-67LI低;分期晚的(C期)，Ki-67LI高，而Bcl-2LI的分期差异无显著性。Ki-67LI≤8%组的活存期较Ki-67LI>8%组为长，两组之间有显著性差异(P<0.05)，而Bcl-2LI在≤40%和>40%组之间差异无显著性。我们以往研究发现，Ki-67和Bcl-2的表达与非霍奇金淋巴瘤(NHL)的恶性程度和预后密切相关[5]。恶性程度低的，Ki-67LI低;恶性程度高的，Ki-67LI高。而Bcl-2LI相反，恶性程度低的，Bcl-2LI高;恶性程度高的，Bcl-2LI低。Ki-67低表达组生存期较高表达组长。Astsaturov等[6]将CLL分为3组(无症状组、治疗有反应组、耐药组)，研究结果发现耐药组的Ki-67阳性率最高。Garcia-Marco等[7]证实伴有12号染色体三体的CLL，其Ki-67阳性率明显高于核型正常或其它核型异常的CLL，且临床呈进行性经过。

　　Niewiadomska等[8]研究发现，CLL疾病进展期患者的Ki-67表达明显高于非进展期的患者，而Bcl-2蛋白的表达与疾病进展无关。由于本组病例观察时间较短，病例数有限，其表达差异是否有助于预后的评估有待于大量病例的研究。

　　【参考文献】

　　1Gerdes J，Lemke H，Baisch H，et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation - associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody. J Immunol，1984; 133: 1710-1715

　　2Hockenbery D，Nunez G，Milliman C，et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature，1990; 348(6299): 334-336

　　3张之南，沈悌，主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社，1998： 228-237

　　4Anonymous. Chronic lymphocytic leukemia: recommendations for diagnosis，staging，and response criteria. Ann Intern Med，1989; 110: 236-238

　　5徐卫，盛瑞兰，郑肇巽等. Ki-67与Bcl-2在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其临床意义. 中华内科杂志，2001; 40: 452-455

　　6Astsaturov IA，Samoilova RS，Iakhnina EI，et al. The relevance of cytological studies and Ki-67 reactivity to the clinical course of chro-nic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma，1997; 26: 337-342

　　7Garcia-Marco JA，Price CM，Ellis J，et al.Correlation of trisomy 12 with proliferating cell by combined immunocytochemistry and fluorescence in situ hybridization in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia，1996; 10: 1705-1711

　　8Niewiadomska H，Mirowski M，Kulczycka D，et al. Some oncogene and tumour suppressor gene protein products expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Cytobios，2000; 103: 159-168