AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究

　　作者：王凯,彭建强,袁振华,吴小兵　　作者单位：长沙湘雅医院血液科，长沙 410008

　　【摘要】本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例，进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用。结果表明： 对于髓系来源的细胞在MOI为30时，AD5/F35载体的感染效率大于99%，AD5载体在MOI为1 000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1 000时，AD5/F35载体感染效率为11.7%，AD5载体为5.7%; AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞，在MOI达到1 000也未检测到荧光阳性细胞。在MOI为1 000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用。结论： AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性，对髓系来源细胞感染能力强，对B系来源细胞有一定感染能力，而且对感染靶细胞毒性小。AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体，在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景。

　　【关键词】 AD5/F35型腺病毒载体

　　Abstract This study was aimed to investigate the transfection efficiency of adenoviral vector AD5/F35 to hematopoietic malignant cells lines of various origins and AD5/F35 cytotoxicity. The hematologic malignant cell lines of various origins were transfected by AD5/F35-EGFP at different multiple of infection (MOI) and AD5-EGFP was used as control; the proportion of fluorescence positive cells was detected by flow cytometry; the killing effect of virus on infective target cells was assayed by MTT and observed by fluorescence microscopy. The results showed that the transfection efficiency of AD5/F35 vector to cell line of myeloid origin was >99% at MOI=30，the transfective efficiency of AD5 vector was 26.4% at MOI=1 000; the transfection efficiency of AD5/F35 vector and AD5 vector to cell line of B cell origin were 11.7% and 5.7%，respectively，at MOI=1 000. AD5/F35 and AD5 vectors could not effectively transfect cells of T cell origin，no fluorescence positive cells were detected at MOI=1 000; no significant killing effect of AD5/F35 vector on infective target cells was observed at MOI= 1 000. It is concluded that AD5/F35 vector infection has difinite selectivity to hematologic malignant cells of varions origin，the infection ability of AD5/F35 vector to cells of myeloid origin is stronger than that to cells of B cell origin，the cytotoxicity of AD5/F35 vector to infective targer cells is small. The AD5/F35 vector is preferable to AD5 vector in respect of infection ability and offers good prospects of application in gene therapy for myeloid leukemia cells as target cells.

　　Key words AD5/F35 adenoviral vector; AD5 adenoviral vector; transfer efficiency; cytotoxicity; malignant hematopoietic cell line

　　腺病毒载体是基因治疗中应用最广泛的病毒载体之一。传统的腺病毒载体基本都是以5型腺病毒为基础构建的，但5型腺病毒载体对造血细胞感染效率低下，在一定范围上限制了它的使用。有研究表明，用35型腺病毒的纤突蛋白改造5型腺病毒可以有效提高对造血干细胞的感染效率[1]。我们使用携带EGFP报告基因的AD5/F35载体，比较了它对不同来源的血液系统恶性细胞感染效率的差异及对所感染靶细胞的毒性作用。

　　材料和方法

　　材料

　　试剂

　　RPMI 1640培养液(Gibco公司产品)，胎牛血清(Hyclone公司产品)，MTT(华美公司产品)。DMSO(Sigma公司产品)。

　　细胞

　　CEM(急性T淋巴细胞白血病细胞株)、HPB-ALL(急性T淋巴细胞白血病细胞株)、Daudi(Bukitt淋巴瘤细胞株)、K562(慢性髓系白血病细胞株)均由中国医学科学院肿瘤研究所提供。

　　病毒

　　AD5-EGFP(滴度6.3×109 TCID 50/ml)，AD5/F35-EGFP(滴度1.3×109 TCID 50/ml)。两病毒均由国家863病毒载体研发基地制备。

　　仪器 流式细胞仪(Courter公司产品)，荧光倒置显微镜(Leica DLIL 德国Leica公司产品)，酶标仪，CO2培养箱(Heraeus 公司产品)。

　　方法

　　感染效率检测

　　受试细胞在25 cm2方瓶用10% FBS培养液培养至对数生长期进行试验。将受试细胞计数后分入EP管，每管5×104细胞，体积为100 μl。分为2组，其中1组感染AD5/F35-EGFP病毒，另1组感染AD5-EGFP病毒。用无血清培养基将AD5/F35-EGFP病毒和AD5-EGFP病毒原液稀释成不同浓度的病毒的病毒悬液，分别以MOI为0、10、30、100、300、1 000加入病毒液到细胞管中混匀，37℃水浴感染2小时。1 500 rmp低速离心10分钟，弃去感染上清，用无血清培养液清洗细胞2遍，转入24孔板，用含10% FBS培养液继续培养48小时。流式细胞仪检测不同感染MOI下荧光阳性细胞比例，并且在荧光显微镜下照相。

　　毒性试验

　　受试细胞在25 cm2方瓶用10%FBS培养液培养至对数生长期进行试验。将受试细胞计数后分入96孔板，每孔1×104细胞，体积为100 μl。每种细胞设AD5-EGFP组、AD5/F35-EGFP组、空白对照组。每个病毒组设MOI为10 、100、 1 000 3个感染剂量，每个剂量设3个复孔。用无血清培养液将AD5/F35-EGFP病毒和AD5-EGFP病毒原液稀释成不同浓度的病毒悬液，每孔加入100 μl，使感染MOI分别达到10、100、1 000。在37℃，5%CO2条件下培养48小时。然后用MTT法检测细胞毒性：每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4小时;2 000 rmp离心10分钟，小心去除上清;每孔加入DMSO 10 μl，震荡;酶标仪测570 mm吸光度(如超出酶标仪上限将全部测试孔稀释1倍后再测)。根据吸光度计算杀伤效率。

　　结果

　　感染效率流式细胞术检测结果

　　对髓系来源的恶性细胞感染效率

　　AD5/F35载体对髓系来源的细胞有较佳的感染效率，在MOI等于30时荧光阳性细胞比例就可达到99%以上;此后随着MOI的升高所表达的荧光强度也逐渐增大。AD5载体感染能力明显低于AD5/F35载体，在MOI达到1 000时荧光阳性细胞比例也 仅为26.4%。MOI从10到300荧光阳性细胞比例分别为5.8%、6.8%、10.3%、16.3%(图1)。

　　对B细胞来源的恶性细胞的感染效率

　　Daudi为B细胞来源的Bukitt淋巴瘤细胞株。AD5/F35载体在MOI为10时荧光阳性细胞比例为6.5%，随着MOI逐渐升高荧光阳性细胞比例逐渐增高，MOI从30到1 000时荧光细胞比例分别为9.1%、9.2%、10.8%、11.7%;AD5载体在MOI为1 000时荧光阳性细胞比例为5.7%，在MOI 300时荧光阳性细胞比例为3.9%，在其余剂量时检测不到荧光阳性细胞。因此，我们认为AD5/F35载体对B细胞来源的恶性细胞感染能力有限，相对AD5载体仍具有一定优势(图3，4)。

　　对T细胞来源的恶性细胞感染效率

　　AD5/F35载体和AD5载体都不能有效的感染T细胞来源的恶性细胞，即使感染MOI高达1 000，也没有检测到表达绿色荧光的细胞(图5)。

　　荧光显微镜照相结果

　　AD5/F35-EGFP和AD5-EGFP两载体感染K562和Daudi的荧光显微镜照相的结果见图6。

　　细胞杀伤作用

　　显微镜下观察各个感染MOI的细胞形态和阴性对照孔之间没有明显差别，MTT检测结果显示，这两个载体即使在最高MOI条件下OD值和阴性对照相比没有显著型差异，说明这两个载体对各个受试细胞没有明显杀伤作用，结果见附表。Table. OD result examined by MTT test (略)

　　讨 论

　　人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(A至F)。常规的2型、5型腺病毒载体属于C组腺病毒，本组腺病毒感染以CAR为主要吸附受体。在造血细胞表面CAR受体表达量低，使得5型腺病毒载体对此类细胞的感染效率低下。35型腺病毒为B组腺病毒。B组腺病毒感染细胞不通过CAR受体。

　　Segerman等[2]曾鉴定出2种不同的B组腺病毒感染受体，他们进一步研究认为，此组腺病毒的感染主要以CD46分子为吸附受体[3]。CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎表达在除了红细胞以外所有人外周血细胞表面。AD5/F35载体是一种“改外壳”的杂合病毒载体，即用B组的35型腺病毒的纤突蛋白替代5型腺病毒的纤突蛋白[4]，改变了5腺病毒原有的感染吸附受体，提高了它对血液细胞的感染效率。从我们的实验结果来看，AD5/F35载体对血液细胞的感染具有一定选择性。AD5/F35载体对髓系来源的K562细胞的感染能力明显优于常规的5型腺病毒载体，在MOI只有30时感染效率就可达到99%以上，而AD5载体即使MOI达到1 000时感染效率也仅为26.4%;但是AD5/F35载体对淋巴细胞感染能力有限，它和AD5载体均不能有效感染T淋巴细胞来源的CEM、HPB-ALL细胞，即使MOI达到1 000也未见荧光阳性细胞，但两者对B淋巴细胞来源的Bukitt淋巴瘤细胞株都有一定感染能力，AD5/F35载体在MOI从10到1 000的范围内均能检测荧光阳性细胞，并随着MOI的增加比例逐渐增高，AD5载体仅在MOI为300、1 000时能检测到荧光阳性细胞，因此认为AD5/F35载体对B淋巴细胞的感染能力略高于AD5载体。在这些细胞株表面都有CD46 分子的表达，对于这种感染选择性的原因一方面可能是由于不同来源细胞的表面CD46受体表达量差异，另一方面CD46被认为并非完全是B组腺病毒吸附的唯一受体，可能还存在其他的辅助受体，如CD55分子[5]。同时，我们的杀伤实验表明，虽然35型腺病毒的纤突蛋白替代5型腺病毒的纤突蛋白改变了载体的感染特性，但是其对细胞的毒性作用并没有因此而增加。我们的研究表明，AD5/F35载体对髓系来源的造血系统细胞有着良好的感染效率，对B系来源的细胞感染能力虽然有限，但仍优于常规的5型腺病毒载体。因此，我们认为AD5/F35载体在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有较好的应用前景。

　　【参考文献】

　　1Shayakhmtov DM，Papayannopoulou T，Stamatoyannopoulou G，et al. Efficient gene transfer into human CD34+ cell by a retargeted adenovirus vector. J Virol，2000; 74: 2567-2583

　　2Segerman A，Arnberg N，Erikson A， et al. There are two different species B adenovirus receptors: sBAR，common to species B1 and B2 adenoviruses，and sB2AR，exclusively used by species B2 adenovirus. J Virol，2003; 77: 1157-1162

　　3Segerman A，Atkinson JP，Marttila M，et al. Adenovirus type 11 uses CD46 as a cellular receptor. J Virol，2003; 77: 9183-9191

　　4Shayakhmtov DM，Li ZY，Ternovoi V，et al. The interaction between the fiber knob domain and the cellular attachment receptor determines the intracellular trafficking route of adenovirus. J Virol，2003: 77: 3712-3723

　　5Sirena D，Lilienfeld B，Eisenhut M，et al. The human membrane cofactor CD46 is a receptor for species B adenovirus serotype 3. J Virol，2004; 78: 4454-4462