HPLCMS/MS法测定人血浆中氨溴索浓度

　　作者：沈卫菊　　作者单位：苏州大学附属第二医院 药剂科，江苏 苏州 215004

　　【摘要】目的 建立测定人血浆中盐酸氨溴索浓度的液相色谱质谱质谱联用法(HPLCMSMS)。方法 血浆中加入内标曲马多，经液液萃取后离心，取上清液吹干，再用甲醇复溶。色谱系统：SYMMETRYTM C18柱(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流动相由20 mmol•l-1乙酸铵水溶液∶甲醇(10∶90)组成，流速为0.6 ml•min-1。质谱检测方式：多重反应监测(MRM)。用于定量分析的离子对分别为质荷比(m/z)379.0→m/z 263.9(氨溴索)和m/z 264.2→m/z 58.1(内标曲马多)。结果 盐酸氨溴索线性范围为0.1～400.0 ng•ml-1，最低检测浓度为0.1 ng•ml-1;标准曲线相关系数r≥0.99。结论 HPLCMS/MS法具有专属、灵敏、准确、操作简单及快速的优点，可以用于测定人血浆氨溴索浓度。

　　【关键词】 盐酸氨溴索,液相色谱,质谱,质谱法 血浆

　　盐酸氨溴索(ambroxol hydrochloride)又名盐酸溴环己胺醇，化学名为反4 [(2氨基3,5二溴苯甲基)氨基]环己醇盐酸盐，是溴己新的体内活性代谢物。氨溴索是一种呼吸道润滑祛痰药，能促使呼吸道表面活性物质形成，调节浆液性与黏液性物质的分泌，增加中性黏多糖分泌，减少酸性黏多糖合成，并促进代谢，使呼吸道黏液理化性质趋正常，利于排出[1]。

　　本实验参考国内外文献[23]，以曲马多为内标，旨在建立液相色谱质谱质谱联用(HPLCMSMS)测定人血浆样品中的氨溴索含量的方法，适用于该药临床口服给药的药代动力学和生物利用度的研究，为临床用药提供参考。

　　1 资料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　氨溴索和曲马多(内标)同为中国生物药品检定所生产，氨溴索批号：200301，纯度为99.5%;曲马多批号：171242200302，纯度为97.9%。甲醇为SK Chemicals产品，HPLC级;灭菌注射用水为安徽双鹤药业有限责任公司产品;乙醚、二氯甲烷、碳酸钠及乙酸铵均为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品，均为分析纯。空白血浆由苏州大学附属第二医院血库提供，于-30 ℃条件下冷冻保存。

　　1.2 仪器及色谱条件

　　测定仪器为API4000三重串联四极杆质谱仪(Applied Biosystem Sciex，USA)，使用Agilent 1200高效液相色谱仪、电喷雾离子源(ESI)及Analyst 1.42数据处理系统;DrictQ5超纯水机(Milli pore);VORTEX2涡旋振荡器;

　　Heraeus低温高速离心机;AS7240B超声波振荡仪;Sartorius BP121S型分析天平和TECHNE DRIBlock DB30氮吹仪。

　　色谱条件：Waters公司SYMMETRYTM C18(150 mm×3.9 mm，5 μm)色谱柱，Phenomenex Security Guard TM C18预柱;流动相由20 mmol•l-1乙酸铵水溶液∶甲醇(10∶90)组成;流速为0.6 ml•min-1;柱温为25 ℃;进样量为10 μl。

　　质谱条件：电喷雾离子化源(ESI);离子喷射电压：5 000 V;离子源温度：500 ℃;GS1：45 psi;GS2：35 psi;碰撞活化气(CAD)压力：6 psi;气帘气(CUR)压力：20 psi;扫描方式为多重反应监测(MRM);氨溴索和内标曲马多的解簇电压(DP)分别为56 V和75 V;碰撞能量(CE)分别为30 eV和75 eV;用于定量分析的离子反应分别为质荷比(m/z)379.0→m/z 263.9(氨溴索)和m/z 264.2→m/z 58.1(内标曲马多)。

　　1.3 血浆样品处理

　　取血浆样品100 μl，加甲醇20 μl、内标曲马多标准溶液(20 ng•ml-1)50 μl、碳酸钠(0.1 mol•l-1)溶液100 μl、提取试剂(乙醚∶二氯甲烷=2∶1，v/v)3 ml，涡流混合30 s。振荡2 min，离心5 min(6 000 r•min-1)，取上清液于30 ℃下氮气吹干，残余物加150 μl甲醇溶解，取10 μl进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 特异性

　　本试验所采用的HPLCMS/MS条件，氨溴索保留时间3.28 min，内标曲马多保留时间2.97 min。氨溴索和曲马多峰形良好，无杂峰干扰，基线平稳。空白血浆中的内源性物质未干扰氨溴索和内标曲马多的测定。图1为氨溴索和内标曲马多的质谱图，图2为血浆中氨溴索和内标曲马多的典型色谱图。

　　2.2 线性范围

　　取空白血浆100 μl，依次加入不同浓度的氨溴索标准溶液20 μl，涡旋15 s，配成含氨溴索的浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 ng•ml-1的含药血浆。记录HPLCMSMS图，计算氨溴索峰面积(As)和内标峰面积(Ai)的比值f(f=As/Ai)。以f对血药质量浓度(x)作回归计算，得回归方程：f=1.177 5 x+0.855 2，r=0.999 3，权重系数w=1/x，药物浓度与峰面积间线性关系良好，线性范围为0.1～400 ng•ml-1(图3)。定量下限为0.1 ng•ml-1。

　　2.3 精密度

　　考察日内精密度与日间精密度(3 d)。按标准曲线配制方法制备含氨溴索浓度分别为0.3、3.0、30.0、300.0 ng•ml-1的含药血浆，每个浓度测定5份样品，连续测定3批，记录HPLCMS/MS图，计算氨溴索峰面积(As)和内标峰面积(Ai)的比值fx(fx=As/Ai)，根据随行标准曲线求得实测浓度。精密度试验结果见表1。表1 精密度试验结果(略)

　　2.4 提取回收率

　　按标准曲线配制方法制备含氨溴索浓度分别为0.3、3.0、30.0、300.0 ng•ml-1的含药血浆，每个浓度测定5份样品。另取空白血浆100 μl，向获得的空白血浆样品上清液加入标准溶液20 μl和内标溶液50 μl，配成相应浓度，涡流混合，于30 ℃下氮气吹干，残余物加150 μl甲醇溶解，取10 μl进行分析。每个浓度测定2份样品，记录HPLCMS/MS图，计算峰面积比值f(f=As/Ai)的平均值fs。将上述fx和fs的比值代入下式即可求得氨溴索的提取回收率(R%),R%=fx/fs×100%。样品提取回收率分别为83.9%、81.6%、79.5%和76.2%。

　　2.5 稳定性试验

　　分别考察了含氨溴索浓度为0.3、3.0、30.0、300.0 ng•ml-1的含药血浆质控样品在室温放置12 h、反复冻融(-30 ℃)3次及冻存(-30 ℃)30 d的稳定性，结果表明氨溴索血浆样品稳定性良好。

　　3 讨论

　　盐酸氨溴索在血浆中的治疗浓度较低，选择一种回收率高、干扰小的提取方法至关重要。目前，国内盐酸氨溴索的体内分析方法包括薄层色谱法、毛细血管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法及液质联用色谱法。这些方法都很费时，同样也需要较大量的血浆样品。本研究利用HPLCMS/MS进行测定，为临床研究建立了一个高灵敏度、高选择性的人血浆中氨溴索的测定方法。

　　血浆样品前处理中，我们曾尝试用乙醚、乙酸乙酯、乙醚二氯甲烷混合物进行提取。结果表明，乙醚和乙酸乙酯提取回收率远低于乙醚二氯甲烷混合物，故选乙醚二氯甲烷混合物作为提取溶剂。血浆样品经乙醚二氯甲烷混合物液液萃取的预处理后，经HPLC分离除去主要内源性干扰后，即可由串联质谱进行专属检测。方法较为简单，萃取回收率高，进样量少，检测限低。

　　国外方法[3]的流动相组成中需用乙腈，本实验则改用甲醇，在获得良好分离效果的同时，降低了分析成本。本方法所需血样仅为0.1 ml，最低检测限可达0.1 ng•ml-1，样品分析时间短。本方法适合大批血浆样品的处理，保证了样品的稳定性及准确性，为体内样本的分析提供了简便、快速、可靠的测定方法。

　　【参考文献】

　　[1]罗蔚慈,甘春兰,朱元钰,等.沐舒坦临床疗效验证63例总结[J].中国新药杂志,1992,1(5):2324.

　　[2]陈琳,高署,李俊杰,等.LCMS法测定人血浆中盐酸氨溴索颗粒浓度及生物等效性研究[J].江西医学院学报,2006,46(6):4350.