血小板膜糖蛋白Ⅰbα基因VNTR多态性与血栓性疾病

　　作者：马芳,李玉云,吴俊英,戴克胜　　作者单位：1.蚌埠医学院医学检验系，蚌埠，233000，2.北京航空航天大学生物工程系

　　【摘要】目的探讨皖北地区汉族人群血小板膜糖蛋白(glycoprotein ,GP)Ⅰbα基因的可变数目串联重复序列( variable number of tandem repeats, VNTR)多态性与血栓性疾病的相关性。方法 采用病例对照研究，用多聚酶链反应技术，结合琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色，对139例血栓病患者(其中冠心病患者88例，脑梗死患者51例)和与病例组年龄、性别相匹配的107例健康者的血小板GPⅠbα基因VNTR多态性进行检测。结果 脑梗死组(CI组)和冠心病组(CHD组)VNTR多态性基因型与对照组相比差异均具有统计学意义。结论 皖北地区汉族人群中血小板膜GPⅠbα基因VNTR多态性CC基因型可能是血栓性疾病的重要遗传易感因素，而BC基因型可能是其重要遗传保护因素。

　　【关键词】 血小板膜糖蛋白Ⅰbα,基因多态性,血栓性疾病

　　Abstract： Objective To investigate the association between variable number of tandem repeats (VNTR) polymorphism in platelet GPⅠbα gene and thrombotic diseases in the Chinese.Methods Casecontrol study was used in this study . Polymerase chain reaction(PCR) technique plus agarose gel electrophoresis(AGE) was performed to analyze for the alleles and genotype frequencies of the VNTR polymorphism in 139 patients with thrombotic events( of which 88 with CHD and 51 with ACI ) and 107 controls without clinical evidence of thrombotic events for their alleles and genotype frequencies of the VNTR polymorphism. Results There were statistical differences in genotype frequency and allele frequency of GPⅠbα gene between patients and controls. Conclusion The VNTR CC genotype is associated with thrombotic diseases,while VNTR BC genotype can protects people from thrombotic diseases.

　　Key words： Platelet membrane GPⅠbα; Genetic polymorphism; Thrombotic events

　　血栓性疾病是当今严重威胁人类健康和生命的一类疾病，特别是冠心病和脑卒中已成为我国人口因病死因的最主要之一。近来, 人们认识到遗传因素在血栓性疾病的发病中具有一定作用。血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)，如GPⅠbα、GPIa/Ⅱa、GPⅡb/Ⅲa，是细胞黏附受体整合素家族的成员，在血栓形成过程中起关键作用，其基因存在多种多态性。研究发现，有些血小板膜GP的基因多态性可能是血栓性疾病的遗传危险因素[1]。

　　我们用流行病学方法结合分子生物学技术,对GPⅠbα基因的可变数目串联重复序列(VNTR)多态性在我国皖北地区人群中的分布频率及其与血栓性疾病的关系进行了研究。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 正常对照组107例, 男69例, 女48例, 年龄60.71土8.01岁, 来自蚌医附院门诊常规体检者, 经病史、体检和实验室检查排除血栓性疾病者，均为无血缘关系的皖北地区汉族人群。急性脑梗死(ACI)患者51例, 男27例, 女24例, 平均年龄65.37士10.03岁。冠心病(CHD)患者88例, 男51例, 女27例, 平均年龄63.19土11.86岁。上述患者均无肝肾等脏器病变, 分别按中华神经科学会和神经外科学会以及WHO的诊断标准确诊。

　　1.2 方法

　　1.2.1 资料收集 询问来自同一地区的对照组成员及患者的病史、家族史、吸烟和饮酒情况, 并测定其血压、心率、血糖、血脂等。

　　1.2.2 血样采集和DNA的制备 取研究对象空腹肘前正中静脉血1.8 ml于枸橼酸钠抗凝的真空采血管中,3 000 r/min离心10 min, 分离血浆及血细胞,-80℃贮存备用。采用人全血基因组DNA抽提试剂盒(Takara公司)抽提DNA, 干燥后溶于TE中, -20℃贮存备用。

　　1.2.3 基因扩增 引物由广州瑞真公司合成，P1：5′TCCACTGCTTCTCTAGACAG 3′ P2：5′GGCTGATCAAGTTCAGGGAT 3′ PCR反应试剂盒(IBM公司) PCR反应总体积为25 μl： 8 μl water free，12.5 μl 2×PCR Master Mix，0.1 μmol/ l的上、下游引物各1μL和DNA模板2 μl。

　　扩增条件 94℃预变性5 min，94℃变性l min，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共32个循环, 最后1个循环延伸7 min。

　　1.2.4 多态性检侧 取PCR产物5～10 μl以2%琼脂糖凝胶电泳30 min，溴乙锭(EB)染色，以100～600 bp DNA作为Marker，在凝胶成像仪下观察结果并照相，确定基因型。

　　1.2.5 统计学分析 应用SPSS 11.5 统计软件包，计算各组等位基因和基因型频率, 吻合度检验确定是否符合HardyWeinberg平衡定律。各组多态性位点基因型和基因频率间的比较应用χ2检验。检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 电泳分析PCR扩增产物 39 bp的核心序列重复4次、3次、2次、1次经PCR扩增后分别产生543 bp、504 bp、475 bp、436 bp的扩增产物，其等位基因依次记作A、B、C、D。理论上，4种等位基因可以产生10种基因型。但本研究仅发现3种基因型：BC、BB、CC。见图1。

　　2.2 冠心病组、脑梗死组和对照组VNTR各基因型及等位基因频率的比较 见表1、表2。经吻合度检验，该位点各基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律，具有人群代表性。脑梗患者组与正常对照组相比各基因型分布差异具有显著意义(χ2=23.89，P< 0.001)，等位基因分布差异无统计学意义(χ2=2.22，P=0.137)，其中VNTR阳性纯合子(CC)使患脑梗的危险度提高了4.12倍(OR=4.12，95%CI：1.96～8.63，χ2=14.97，P< 0.001);冠心病患者组与正常对照组相比各基因型、等位基因分布差异均具有显著意义(χ2=38.240，P< 0.001;χ2=7.825，0.005< P<0.01)，其中VNTR阳性纯合子(CC)使患冠心病的危险度提高了5.31倍(OR=5.31，95%CI：2.77～10.16，χ2=27.41，P < 0.001)，C等位基因使患冠心病的危险度提高了1.79倍(OR=1.79，95%CI：1.19～2.70，χ2=7.83，0.005

　　△χ2=38.24，P< 0.001; △△χ2=7.83，P= 0.005 ，OR(95%CI)=1.79(1.19～2.70 )。表2 冠心病组、脑梗死组和正常对照组VNTR基因型频率的比较注：与正常对照组相比，χ2=14.97，P< 0.001，OR(95%CI)=4.12(1.968.63);

　　χ2=27.41，P< 0.001， OR(95%CI)=5.31(2.7710.16 )。括号内为百分比。

　　3 讨 论

　　血小板表面受体基因的多态性能够调节其表面受体蛋白的表达水平和结构，从而影响血小板的黏附、聚集等一系列反应，进而调节血栓形成。在高切变力诱导下,血小板GP I b/Ⅸ/V 复合物的GP I bα亚基与血管性血友病因子(vWF) 相互作用,在血小板的活化及血栓形成中起关键作用[2]。

　　VNTR多态性，是GPⅠbα的巨糖肽区的串联重复序列，相当于cDNA序列1 285～1 323位的39个碱基对，编码丝氨酸399～苏氨酸411的13个氨基酸区段。每个重复序列使蛋白质分子长度增加13个氨基酸,使vWF结合区远离血小板膜，从而将分子暴露于更大的切变力,导致切变力诱导的vWF和GP I bα相互作用的阈值降低。此外,与vWF的有效结合需要至少包含两条GP I bα多肽链的超复合体,不对称长度的GPIbα多肽配对将导致与配体结合能力的相对减弱[3]。这两点可能是VNTR多态性影响GP I bα受体功能的原因。

　　VNTR在不同地域、不同民族间分布有一定差异。我们对皖北地区汉族人群VNTR多态性进行研究,结果仅出现两种等位基因: B、C, 未见A、D。Ishida等[4]对日本人的研究结果表明VNTR呈A(15.5%)、B(1.0%)、C(53.9%)、D(29.6%)等4种, 可见本研究结果与日本人群VNTR多态性显著不同。江雁等[5]对天津地区汉族人VNTR多态性的研究结果表明有A(0.43%)、B(3.33%)、C(60.14%)、D(36.1%)等4种等位基因出现, 与皖北地区VNTR多态性也大不相同,这种差异可能是由于地域不同, 环境与基因相互作用的结果, 也可能是由样本选取的标准、样本的大小、试验设计等的不同所引起, 尚待进一步研究证实。

　　1996年，德国Weiss等首先报道了血小板膜GPⅢa的P1A1/P1A2多态性与心肌梗死的发生有关，随后，在国外不同人种中均有关于血小板GP基因多态性与血栓性疾病关系的研究[6]， 但结果大相径庭。1998年，Murata等在41例冠状动脉疾病患者和86例健康人中测定了VNTR，并报道A VNTR是冠状动脉疾病的一个独立危险因子。Christian Meisel等[7]对149例急性非致死性心肌梗死病人和207例正常对照的研究表明，VNTR与急性非致死性心肌梗死无相关性。Ozelo等[8]对巴西人的研究结果显示,心肌梗死患者中VNTR CD的频率是正常人的2倍,而VNTR BC的频率则低于正常对照，这与本研究结果显示的皖北地区脑梗死患者和冠心病患者中VNTR BC的频率(27.4%和25.0%)均低于正常对照(68.2%)有相一致之处。AfsharKharghan等[9]报道，与其他基因型相比，CC纯合子与较低的冠心病发生率有关，这与本研究结果恰好相反。但Carlsson未见VNTR等位基因与脑梗死相关.Feinbloom等[10]则认为VNTR BC基因型与冠心病存在关联性。这与本研究结果显示的皖北地区人群VNTR等位基因B、C与脑梗死无关(P>0.05)，VNTR BC基因型与冠心病存在关联性(P<0.001)，并且是冠心病的遗传保护因素，也有一定相一致之处。本研究结果表明,皖北地区VNTR多态性可能是该地区血栓性疾病发病的主要原因之一。

　　我国是个多民族的国家,各民族间在基因多态性上可能存在差异, 而且与国外人种会有更大的差异。本研究对象生活在皖北地区，样本量相对较小，缺少含A、D等位基因的个体;其次，病例组选于存活的脑梗死和冠心病患者，生存偏倚性不可避免。尚需大规模深入研究，进一步确定GPⅠbα基因VNTR多态性与血栓性疾病的关系，以了解我国同世界其他人种间基因多态性的差异。

　　【参考文献】

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　　[10] FEINBLOOM D, BAUER KA.Assessment of Hemostatic Risk Factors in Predicting Arterial Thrombotic Events[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25:20432053.