凝血酶与肿瘤转移

　　作者：孟宇宏,虞积耀,陆应麟　　作者单位：中国人民解放军海军总医院病理科，北京 100037;1军事医学科学院基础医学研究所，北京100850

　　【摘要】凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在体内一系列生理和病理过程中起重要作用。它不但参与止血和凝血、炎症、免疫反应、组织修复和创伤愈合，而且可激活正常细胞的致瘤潜能和导致恶性细胞的转移表型。凝血酶是肿瘤细胞的促有丝分裂剂，能够增强肿瘤细胞对细胞因子的增殖反应，增强肿瘤细胞对血小板的黏附及体外细胞基质的侵袭，促进肿瘤血管形成和肿瘤微环境的组织重建。凝血酶受体家族 PARs介导凝血酶的细胞生物学效应。凝血酶对肿瘤细胞生长具有双向调控作用，低浓度者促进生长，高浓度者抑制生长，甚至导致肿瘤细胞凋亡。本文就凝血酶的生物学功能、凝血酶与肿瘤及凝血酶受体等进行综述。

　　【关键词】 凝血酶,肿瘤,肿瘤转移

　　Abstract Thrombin is a multifunctional serine protease that plays a key role in a variety of physiological and pathological conditions. In addition to the role in hemostasis and coagulation, thrombin has other numerous biological activities affecting inflammation, immune responses, tissue repair and wound healing. Apart from its physiological role thrombin activates the oncogenic potential of both normal and malignant cells and leads a metastatic phenotype. It is a potent mitogen for many tumor cells. It potentiates the proliferative response of tumor cells to some growth factors, increases the adhesive properties to the platelets and invasion processes of tumor cells to the extracellular matrix, enhances the metastatic capacity of tumor cells，activates angiogenesis and remodels the microenvironment of the tumor. The cellular biological effects of thrombin are mediated at least in part by a new subfamily of Gproteincoupled receptors designated proteinaseactivited receptors(PARs). Thrombin has a bilateral effect on tumor cells:enhanced growth at low concentration, impaired growth/apoptosis at higher concentration. In this papers, the biological function of thrombin, thrombin and tumors, and thrombin receptors etc were reviewed.

　　Key words thrombin; tumor ;metastasis

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):671-674

　　侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主细胞和组织微环境之间一系列复杂、多步骤、多因素、多功能的相互作用的序贯连续过程。此过程涉及到多种成分(肿瘤细胞、宿主细胞、细胞外基质)、多种细胞功能(黏附作用、降解作用、运动作用)及多种基因(转移抑制基因、黏附分子及其受体、细胞外基质降解酶、运动因子、趋化因子等)。细胞外基质的重塑是肿瘤局部侵袭的必需环节，细胞外基质成分的降解是完成转移的关键步骤之一。在肿瘤侵袭和转移过程中，各种蛋白酶与其表面特异性受体组成的细胞外蛋白分解系统被周密的调节以适应细胞功能和降解选择性的基质屏障。

　　众所周知，血栓形成是恶性肿瘤常见的并发症，而血栓形成与癌症播散之间的因果关系最近越来越多地为人们所重视。研究表明，恶性肿瘤细胞具有促凝血活性，而这种促凝血活性又与其转移潜能密切相关。凝血酶(thrombin)是一种凝血系统重要的酶，除了其生理作用外，在导致正常细胞的致瘤潜能和恶性细胞转移表型方面起重要作用[1]。

　　凝血酶

　　人类凝血酶原cDNA由26 929 bp组成。凝血酶原基因位于11号染色体，由14个外显子和13个中间(intervening)序列组成。凝血酶在肝脏合成，在其分泌之前要经历一系列后转化。39 kD 的凝血酶由两条链构成，4个二硫键使两条链交叉相连。这4个二硫键组成1个狭窄的凹陷，内含由His57,Asp102,Ser205组成的接触反应三联体。这个疏水性的部位是凝血酶的敏感部位，对非极性氨基酸精氨酸亲和， Leu Asp Pro Arg/Ser 代表其裂解部位，凝血酶对其底物和受体的高度特异性是由此独特的阴离子结合部位决定的[2]。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)凝血酶与肿瘤转移凝血酶是一种生长调节蛋白，其更重要的一些生物学特性则依赖于其丝氨酸蛋白酶的功能。它能使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，激活血小板的黏附、聚集和分泌，促进一些细胞的趋化和黏附，引起原始内皮细胞、血管平滑肌细胞和纤维母细胞的促有丝裂反应。在肿瘤细胞的作用方面，凝血酶能促进肿瘤细胞的有丝分裂和对一些细胞因子的增殖反应，还能增强肿瘤细胞对血小板的黏附及细胞外基质的侵袭，并引发体内的转移。凝血酶的合成、降解和活性调节

　　凝血酶的蛋白分解活性在严密的调节控制下完成，其蛋白分解活性由凝血酶前体复合物(凝血酶原、Fxa、Fva、血小板因子3、Ca2+)介导。有活性的凝血酶使纤维蛋白原变为纤维蛋白后，就很快与其抑制剂结合。凝血酶的抑制剂包括抗凝血酶、α2巨球蛋白、肝素辅因子Ⅱ、蛋白酶连接蛋白1和α1抗胰蛋白酶，其中最重要的失活模型是通过与抗胰蛋白酶结合实现的，二者的结合物被运送至肝脏，在Kupffer细胞内降解。血液循环以外的凝血酶抑制剂包括凝血调节因子和S蛋白。

　　凝血酶的一般生物学功能

　　凝血酶在血液凝固、炎症、创伤修复和组织重塑、胚胎发生、血管形成、动脉硬化的发生发展等生理及病理过程中都发挥着重要作用[3]。在血液凝固方面，凝血酶促进血小板聚集，并在血液凝固级联反应的最后阶段转化纤维蛋白原为纤维蛋白。在炎症反应和创伤愈合过程中，凝血酶趋化并促进单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞到达损伤部位，同时促使上述细胞分泌细胞因子和化学因子(血小板释放血栓素A2、血小板因子4、PDGF和 TGFβ等炎症介质)，增强NK细胞的细胞溶解能力。凝血酶对血管内皮细胞的作用主要是激活内皮细胞释放前列环素、 内皮素1和NO，并通过激活NFκB而引起内皮细胞表达黏附分子ICAM(CD45)和VCAM(CD106)[4]，增强血管的通透性，促进白细胞的游出。更重要的是凝血酶做为一种促有丝分裂剂可促进平滑肌细胞、纤维母细胞、内皮细胞、单核细胞的增殖。以上过程都是炎症和创伤修复过程中必不可少的条件。另外，凝血酶还在调节神经起源细胞的生长和分化以及骨的形成方面起作用[5]。

　　凝血酶与肿瘤

　　大多数实体肿瘤的患者都伴有不同程度血液凝固激活而表现为所谓的“高凝状态”或称为“低级别的DIC”。癌症患者体内凝血系统被激活预示凝血酶在肿瘤生物学方面发挥重要作用，凝血酶与癌的生物学行为之间关系也越来越多地引起人们的关注。肿瘤/宿主产生的内源性凝血酶在肿瘤细胞的种植、播散和自发性转移过程中发挥作用[6]。在肿瘤细胞周围聚集的凝血酶可直接激活肿瘤细胞，增强肿瘤细胞对血小板、内皮细胞、内皮下基质(纤维连接蛋白、vW因子)的黏附;促进肿瘤细胞生长，增强肿瘤细胞的致瘤性，促进肿瘤细胞的迁徙与转移。同时促进肿瘤血管形成和肿瘤微环境中的组织重建。

　　凝血酶介导肿瘤细胞诱发的血小板聚集，增强肿瘤细胞对内皮细胞及细胞外基质的黏附。用凝血酶处理过的肿瘤细胞对血小板及黏附配体(纤维连接蛋白和vWF)因子的黏附性更强。凝血酶还可通过诱发和增强肿瘤细胞对内皮细胞及内皮下基质成分的黏附而使其转移潜能增强[7，8]。用抗αⅡbβ3整合蛋白抗体预处理肿瘤细胞可使凝血酶的黏附效应减弱或消失，说明凝血酶促进肿瘤细胞对内皮细胞和细胞外基质的黏附性是通过增加肿瘤细胞表面αⅡbβ3整合蛋白的表达而介导的。凝血酶的黏附效应可被外源性硝基α凝血酶模拟，而不能被凝血酶原或活性部位抑制凝血酶原的同类物模拟[9]。

　　凝血酶影响肿瘤细胞的生长行为，增强肿瘤细胞的致瘤性并引发转移表型。凝血酶对许多肿瘤生长都有双向作用。凝血酶对肿瘤细胞生长的双向效应有量和时间的依赖性。一方面，低浓度(低于0.5 U/ml)凝血酶在增加肿瘤转移潜能的同时还能促进肿瘤细胞的生长，凝血酶可促进肿瘤细胞生长，凝血酶处理的肿瘤细胞至少具有2倍以上在肺的转移灶形成能力，应用水蛭素(凝血酶抑制剂)能够成功的抑制黑色素瘤的实验性肺转移[10，11]。凝血酶抑制剂阿加曲班(argatroban)不但能够抑制体外黑色素瘤细胞的迁移，而且还能有效的减少黑色素瘤细胞在动物体内骨转移的数量[12]。由于许多肿瘤局部蛋白酶和组织因子的表达导致凝血酶激活而使宿主体内产生过多的纤维蛋白，这些纤维蛋白是肿瘤细胞的重要生长因子，储积的纤维蛋白能够促进肿瘤生长、血管形成和远处转移;凝血酶本身也是肿瘤细胞的促有丝分裂剂，它通过增强肿瘤细胞对上皮生长因子(EGF)、胰岛素(insulin)、运铁蛋白(transferrin)等的增殖反应而增强癌细胞的转移表型[13]。用凝血酶处理过的肿瘤细胞注入小鼠的尾静脉后，可使其实验性肺转移增加10156倍。另一方面，高浓度(至少0.5 U/ml)的凝血酶可抑制肿瘤细胞生长，甚至导致肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞暴露于凝血酶时间大于16小时可降低其侵袭力，大于24小时则引起细胞凋亡 。凝血酶导致凋亡的机制可能是由于它含有RGD肽(精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成的三肽，一种细胞外基质蛋白分解产物)。近来证实后者可进入细胞内通过与caspases的RGD基序(motif) 相互作用而激活caspases[14]。凝血酶引发的人类肿瘤细胞凋亡信号通路涉及caspases、PKC、PI3K、非特异性酪氨酸激酶和完整的细胞骨架。凝血酶引起神经元凋亡的浓度比肿瘤者要高80-200倍，正常人周围血单核细胞也相对抵抗凝血酶的促凋亡效应。这种正常细胞对凝血酶引起细胞凋亡的相对抵抗性，提示凝血酶或其模拟肽可能是潜在性的抗癌制剂，将来可能会产生新的以凝血酶为基础的临床抗癌疗法[15]，这有待今后深入研究。

　　凝血酶在肿瘤血管生成方面也具有作用。血管形成是肿瘤生长和转移所必需的条件，而凝血酶是血管形成的有效促进剂。用凝血酶孵育人类纤维母细胞、前列腺肿瘤细胞和巨核细胞，可使其VEGF mRNA表达增强; VEGF mRNA表达增强并非继发于转录增强，而是继发于mRNA的稳定性增加。凝血酶还能诱导人类脐静脉内皮细胞中红细胞生成素2的mRNA表达增强，继而导致其蛋白合成和分泌增加。已经证实，基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease, MMP)与肿瘤血管形成和肿瘤侵袭密切相关，而凝血酶与MMP在肿瘤血管早期形成阶段起协同作用，用凝血酶处理内皮细胞可增加其MT1MMP的表达，凝血酶还可通过MT1MMP非依赖机制而快速有效的激活人类微血管内皮细胞的MMP2[16，17]。凝血酶在细胞水平上促进血管生成的作用包括：①降低内皮细胞对基底膜蛋白的黏附能力;②增强VEGF引起的内皮细胞增殖，这一过程伴随VEGF受体表达上调;③增加αvβ3整合蛋白的mRNA和蛋白表达;④增加VEGF的分泌。这些结果说明凝血酶对血管发生和肿瘤的促进作用，并为发展凝血酶受体模拟或拮抗剂做为治疗措施提供了基础[18]。

　　凝血酶能通过影响肿瘤微环境中其它细胞的行为而为肿瘤转移提供一个相容的环境。凝血酶激活血小板对其它细胞和细胞外基质的黏附，增强血管的通透性和黏附分子的表达，趋化单核细胞，激发内皮细胞和纤维母细胞的核分裂活性，使肥大细胞脱颗粒。肿瘤微环境中这些细胞的相互作用过程即是肿瘤转移过程中间质重建的过程[19]。

　　凝血酶受体

　　近来发现凝血酶的一些细胞生物学效应是通过一个新的G蛋白偶联受体家族——蛋白酶激活受体家族(proteaseactivated receptors, PAR)介导的。目前共发现了3个凝血酶受体家族成员，它们分别是PAR1，PAR3和PAR4。它们的共同特点是凝血酶可特异性地裂解受体的细胞外N末端，使其暴露1个新的氨基酸末端，后者又作为配体与受体本身第二个袢的细胞外区结合而使其自身不可逆的激活，继而转导其它的细胞信号[11]。

　　PAR1是凝血酶的主要受体，它介导凝血酶引发的生物学效应，参与凝血酶或PAR1激活肽引发的肿瘤细胞对内皮细胞、细胞外基质和血小板的黏附，介导凝血酶促进的瘤细胞的转移，参与肿瘤细胞的生长调节和血管的生成。PAR1可调节程序性细胞死亡。根据其生理激动剂凝血酶或人工合成受体激活物量的不同，激活PAR1可诱导或抑制不同类型细胞的凋亡。目前发现，PAR1介导凋亡作用的靶细胞包括神经元、内皮细胞、纤维母细胞和肿瘤细胞。由PAR1激活而引起的诱导或阻止凋亡的信号通路各不相同，包括：JAK/STAT、RhoA、myosin light chain kinase(肌球蛋白轻链激酶)、ERK1/2 和各种 Bcl2 家族成员[20，21]。黑色素瘤细胞中PAR1的过度表达伴随着AP2的表达缺失，因而推测PAR1的作用受AP2调节，AP2的缺失导致PAR1过度表达，后者通过上调黏附分子、蛋白酶和血管生成分子而引发黑色素瘤的转移表型[22]。

　　某些人类肿瘤中存在着PAR的双受体系统。原代培养的星形细胞瘤中存在PAR1和PAR4双受体系统，凝血酶、SFLLRN(PAR1激活肽)、GYPGQV(PAR4激活肽)可影响细胞内Ca2+信号的产生，说明PAR1/PAR4受体系统参与星形细胞瘤的细胞功能调节[23]。原代培养的肾细胞癌也存在PAR1及PAR3在蛋白和mRNA的联合表达，两者均定位于细胞外膜及细胞内池。用凝血酶刺激单个癌细胞，28/30个细胞可检测到单向Ca2+信号[24]。对于双受体在凝血酶引起的信号转导中起叠加作用，还是有其各自的独立功能，这些问题尚需进一步研究。

　　结语

　　总之，凝血酶不但是正常或病理条件下重要的凝血因子，在血栓形成、血管损伤、炎症、组织损伤修复方面均起重要作用，而且是促进肿瘤细胞转移的重要因素之一。 在癌症患者中，由于凝血系统广泛的过度激活，直接导致凝血酶的大量产生。此外肿瘤微环境的细胞外基质中富集了丰富的可溶性或固定的凝血酶，这些凝血酶参与介导肿瘤细胞侵袭、细胞外基质降解、血管形成和组织的重建。凝血酶受体家族 PARs介导凝血酶部分细胞的生物学效应。

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