垂体瘤转化基因在多发性骨髓瘤患者中表达的研究

　　作者：王昭　鹿全意　陈萍　张鹏　丛雅琴　　作者单位：厦门大学附属中山医院血液科，厦门 361012; 1济南市中心医院血液科，济南 250012; 2山东大学齐鲁医院血液科，济南 250012

　　【摘要】为了研究垂体瘤转化基因(pituitary tumor-transforming gene, PTTG)在老年多发性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)患者中的表达并分析它与MM发生的关系，采用RT-PCR方法检测33例MM患者及10例正常对照者骨髓单个核细胞中PTTG的表达。 结果表明： MM患者PTTG在MM中的表达水平(0.3415±0.2172 )明显高于正常对照组(0.0590±0.0233) (P<0.05)。 结论： PTTG的过度表达可能与MM的发生发展有关，这为MM的发病机制及其基因靶向治疗的研究提供了新的思路。

　　【关键词】 垂体瘤转化基因,多发性骨髓瘤,逆转录聚合酶链反应　垂体瘤

　　AbstractTo explore the expression of pituitary tumor-transforming gene (PTTG) in elderly patients with multiple myeloma (MM)and its relationship with MM, the expressions of PTTG mRNA were detected in bone marrow mononuclear cells (BMMNC) from 33 patients with MM and 10 normal controls by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) . The results showed that the expression of PTTG mRNA in MM patients (0.3415±0.2172) was significantly higher than that in normal controls (0.0590±0.0233) (P<0.05). It is concluded that the overexpression of oncogene PTTG may be related to genesis and progression of MM. It provided a new ideas to study the pathogenesis and gene therapy for MM patients.

　　Key wordspituitary tumor-transforming gene; multiple myeloma; reverse transcription-polymerase chain reaction; pituitary tumor

　　多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞恶性增生性血液肿瘤，患者骨髓内有大量异常浆细胞增殖，血清中出现异常的单克隆免疫球蛋白。发病率占血液肿瘤的10%，中、老年人中发病率较高。新近报道的癌基因垂体瘤转化基因(pituitary tumor-transforming gene , PTTG)，其高表达在促进细胞增殖、转化及肿瘤发生中具有十分重要的作用, PTTG在恶性肿瘤中的高表达和转化能力证实了其与肿瘤的发生有关[1]。国内外已有报道PTTG在胃癌[2]和乳腺癌 [3]等多种肿瘤中高表达，但PTTG在MM中的表达尚未见文献报道。我们用RT-PCR方法检测33例MM患者中PTTG的表达情况,进一步分析PTTG与MM的关系。

　　材料和方法

　　临床资料

　　33例MM患者来自山东大学齐鲁医院2003年3月至2005年5月的门诊及住院病人，其中初诊MM 14例、复治19例。全部病例均经骨髓涂片、免疫球蛋白定量、血清M蛋白电泳、X线等检查确诊。33例病人中男22例，女11例，年龄54-76岁，中位年龄66岁。按照M蛋白免疫学分型：IgG型18例，IgA型7例，IgD3例，轻链型5例。住院患者应用MP方案(马法兰、泼尼松)、M2方案(马法兰、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺)、VAD方案(长春新碱、阿霉素、地塞米松)并配合应用反应停多次化疗。10例对照者为门诊同期就诊的良性血液病患者(缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血和白细胞减少症)，男6例，女4例，年龄18-64岁，中位年龄38岁。

　　试剂与仪器

　　PBS(pH 7.4)缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司。淋巴细胞分离液购自济南爱博公司。 -80℃超低温冰箱为日本Sanyo公司产品，TGL-16B型台式高速离心机为上海安亭科学仪器厂制造， RT-PCR试剂盒(购自Progoma公司)由下列成分组成： GIT变性液(10 ml)， 2 mol/L NaOAc (pH 4.0)(1 ml)，MMLV 逆转录酶200 U/μl(20 μl)，逆转录反应体系，Taq DNA 聚合酶1 U/μl (40 μl)，PCR反应体系，去RNase水。水平电泳槽为北京六一试验仪器厂产品;PTC-150型PCR扩增仪为美国MJ Reseach公司产品;EC250-90多功能电泳仪为美国EC公司产品;ZF-4型多功能紫外投射反射分析仪为上海长明光学电子仪器厂制造; 1D Image Analysis Software凝胶分析系统为美国Kodak公司产品。

　　实验方法

　　分离单个核细胞所有病例均在无菌条件下抽取骨髓2 ml并将其注入EDTA抗凝试管中, 加入4 ml PBS(pH 7.4)缓冲液稀释。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞，-80℃保存备用。

　　总RNA的提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA。

　　所抽提总RNA经分光光度计测定260和280 nm处吸光度(A)值，A260/A280值在1.85-1.98者用于RT-PCR。

　　引物设计PTTG引物序列： P1 5'-CGATGCCCCACCAGCCTTACC-3'，P2　5'-CAAGCTCTCTCTCCTCGTCAAGG-3'，扩增产物317 bp; β-actin引物序列: P1 5'- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3'， P2 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，扩增产物539 bp。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　逆转录反应(RT)在经DEPC处理过的0.5 ml Eppendorf管中加入逆转录反应体系： 细胞总RNA 1 μg, MMLV-RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, MMLV RT) 1 μl, dNTP 1 μl, DTT 2 μl, buffer 4 μl, 下游引物1 μl, 去RNase水10 μl。快速离心混匀;37℃ 1小时，95℃ 10分钟灭活MMLV; 快速离心使蒸汽沉于管底。

　　聚合酶链反应(PCR)在上述20 μl RT产物的0.5 ml Eppendorf管中加入PCR反应体系：dNTP 1 μl, buffer 10 μl, MgCl2 8 μl, Taq酶2 μl，上游引物P1 1 μl，超纯水 58 μl。快速离心混匀;95℃ 5分钟，冰浴冷却,然后快速离心使蒸汽沉于管底.加入2 μl(1 U/μl)Taq DNA 聚合酶,快速离心混匀,加入60 μl液体石蜡。循环条件: 94℃ 1分钟、58℃　1分钟、72℃ 1分钟;共35个循环,最后72℃延伸7分钟,然后进行电泳鉴定。

　　定量分析

　　凝胶电泳图像输入Kodak 凝胶分析系统, 应用1D Image Analysis Software 进行表达强度分析。结果判断以同时扩增的内参照β-actin 的表达强度为基准,各细胞因子的表达强度按下式计算：表达强度(相对系数) = 细胞因子A值/β-actin A值相对系数> 0.1 为阳性,未观察到阳性电泳条带或条带位置不正确为阴性。统计处理时按< 0.1 计算。

　　统计学处理

　　应用SPSS 11.5 for windows 统计软件分析实验结果。数据以均数±标准差( ±SD)表示，采用独立样本的t检验进行统计学处理，多个样本均数的比较采用单因素的方差分析, P<0.05为差异具有统计学意义。

　　结果

　　PTTG在多发性骨髓瘤患者中的表达

　　MM患者骨髓单个核细胞PTTG表达的电泳结果见附图和表1。 从电泳图及表达水平差异的统计学分析可以看出，MM患者组PTTG的表达水平均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Table 1. Expressions of PTTG in controls and MM patients (略)

　　MM按不同M蛋白免疫学分型PTTG的表达

　　检测结果见表2。按照M蛋白免疫学分型，PTTG在IgG型、IgA型、IgD和轻链型中的表达差异无统计学意义(F=0.554， P>0.05)。Table 2. Expressions of PTTG in different immunologic subtypes of MM (略)

　　讨论

　　PTTG是 Pei等[4]在垂体瘤细胞中发现并命名的一种新的肿瘤转化基因，在正常垂体细胞中不表达。但大量研究显示，这一新基因在大多数正常成人组织只有弱表达，甚至检测不到，而在肿瘤组织及肿瘤细胞系，如乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤中表达明显升高。研究发现，将PTTG cDNA的NIH3T3细胞做无胸腺裸鼠皮下种植，3周内能诱发肿瘤形成。PTTG的过度表达能引起P53依赖性和非P53依赖性的细胞凋亡和细胞非整倍体的形成[5]。肿瘤的发生是多基因多步骤下发生的，PTTG与大多数肿瘤发生密切相关，PTTG在肿瘤形成过程中究竟和其它癌基因之间有何联系尚待进一步的研究。多发性骨髓瘤(MM)是一个多因素参与的多阶段恶性转化过程，包括癌基因与抑癌基因在内的多种基因结构及功能的改变，基因的选择性表达决定细胞的生长、发育和分化，与肿瘤的增殖、侵袭、转移等生物学行为相关。但MM发病的分子机制仍不清楚。PTTG作为一种新发现的癌基因，对多发性骨髓瘤发生发展过程中关键差异表达基因的分离和克隆，可以从分子水平进一步阐明多发性骨髓瘤的分子机理，并为疾病的早期诊断和基因靶向治疗提供理论依据。为了研究PTTG在MM中的表达情况及它们的关系，我们应用RT-PCR方法对33例MM患者的骨髓单个核细胞PTTG的表达进行了研究，结果显示： PTTG在MM中表达升高，明显高于对照组，推测 PTTG的过度表达可能与MM的发生有关。在我们的数据中分析中，PTTG在MM的IgG型、IgA型、IgD和轻链型不同M蛋白免疫分型中的表达差异无统计学意义，这一结论尚有待于多中心大样本资料证实。基础研究发现： PTTG的过度表达抑制了姐妹染色单体的分离，破坏细胞分裂，导致染色体不稳定性[6]。PTTG诱导肿瘤形成是由于姊妹染色单体不能分离，导致非整倍体的形成，进而导致恶性克隆的形成。通过细胞遗传学及分子生物学技术检测发现，MM中存在多种染色体的异常，因而推测PTTG的过量表达可能参与了MM的发生。但PTTG的表达在MM发病中的具体机制，及其治疗前表达水平与预后的关系，目前尚不清楚，我们将继续进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Dominguez A, Ramos-Morales F, Romero F, et al. hpttg, a human homologue of rat pttg, is overexpressed in hematopoietic neoplasms. Evidence for a transcriptional activation function of hPTTG. Oncogene, 1998; 17:2187-2193

　　2 Wen CY, Nakayama T, Wang AP, et al. Expression of pituitary tumor transforming gene in human gastric carcinoma. World J Gastroenterol, 2004; 10:481-483

　　3 Saez C， Pereda T， Borrero JJ， et al. Expression of hpttg proto-oncogene in lymphoid neoplasias, Oncogene, 2002; 21 : 8173-8177

　　4 Pei L, Melmed S. Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene(PTTG). Mol Endocrinlol , 1997; 11:433-441

　　5 Yu R, Heaney AP, Lu W, et al. Pituitary tumor transforming gene causes aneuploidy and p53-dependent and p53-independent apoptosis. J Biol Chem,2000; 275: 36502-36505

　　6 Zou H, McGarry TJ, Beral T, et al. Identification of a vertebrate sister-chromatid separation inhibitor involved in transformation and tumorigenesis. Science, 1999; 285(5426):418-422