伴显著淋巴结腺体肿大的inv(16) AML 一例

　　作者：周惠芬,李建勇,钱思轩　　作者单位：南京医科大学第一附属医院、江苏省人民医院血液科，南京 210029;基金项目：江苏省135工程医学重点人才基金资助，编号 RC2002044

　　【摘要】为了探讨伴inv(16)急性髓细胞白血病(AML)预后的异质性，本研究报道1例伴有显著淋巴结腺体肿大inv(16) AML的诊治经过，并对相关的问题进行了讨论。结果显示：患者男，13岁，确诊M4Eo伴inv(16)，并全身显著淋巴结肿大，予以大剂量阿糖胞苷(HDAC)的方案化疗。荧光原位杂交(FISH)技术监测疗效显示患者对HDAC反应不敏感。结论：伴有淋巴结腺体肿大的inv(16) AML对HDAC反应不敏感，预后较不伴淋巴结腺体肿大者差。inv(16) AML预后存在异质性。FISH技术是准确可靠的inv(16)检测手段，可用于监测inv(16)的微小残留病灶。

　　【关键词】 inv(16) AML,淋巴结腺体肿大,荧光原位杂交

　　AbstractThe study was aimed to investigate the different prognosis of acute myeloid leukemia(AML) with inv(16). A 13-year-old patient diagnosed as M4Eo presenting with bulky lymphadenopathy was reported, the curative process of patients was presented and the related issues were discussed. The karyotype and inv(16) were detected by conventional cytogeneties and fluorescence in situ hybridization (FISH), respectively, the immunophenotype was detected by flow cytometry. The results showed that conventional cytogenetics and FISH analysis revealed inv(16). Induction therapy included idarubicin and cytarabine. After complete remission, patient received consolidation theray containing high-dose cytarabine (HDAC). FISH analysis revealed poor response of patient to HDAC. It is concluded that bulky lymphadenopathy in AML with inv (16) may be a negative prognostic sign. FISH for inv(16) is specific and constitutes an reliable tool to be used for diagnosis and minimal residual disease (MRD).

　　Key wordsinv(16) AML;Lymphadenopathy;FISH

　　inv(16)是急性髓细胞白血病(AML)特征性的异常核型，1983年Arthur和Bloomfield[1]首次报道了5例骨髓嗜酸细胞增多伴16号染色体异常的患者，当时描述为del(16)(q22)，后陆续有inv(16)(p13q22)、t(16;16)( p13;q22) 及ins(16) (q22;p13.1p13.3) 的报道，其中以inv(16)最为多见。1985年FAB分型将这类骨髓中出现一定比例的异常嗜酸细胞的M4患者独立分型为M4Eo。WHO分型[2]将之列入伴再现性遗传学异常的AML，命名为伴inv(16) (p13q22)或 t(16;16)( p13;q22)，(CBF -MYH11)AML。inv(16)见于5%-10%的AML，是预后较好的一个标志，对大剂量阿糖胞苷(HDAC)反应敏感，但也有报道认为，伴有淋巴结腺体肿大的inv(16) AML对HDAC反应不敏感，较不伴淋巴结腺体肿大者预后差。本研究报道1例伴显著淋巴结腺体肿大的inv(16) AML。

　　材料和方法

　　病例资料

　　患者男，13岁，因"咽痛、咳嗽半月，发现淋巴结肿大2天，于2004年12月18日入院。患者入院前半月受凉后出现咳嗽，咽痛、鼻塞，自服 "康泰克"症状有所改善，但数日后又反复，伴盗汗，无发热，1个月体重下降约3 kg。入院前两天发现全身多处淋巴结肿大，于我院就诊，血常规检查显示： WBC 66.4×109/L，

　　Hb 109 g/L， Plt 34×109/L，遂收住入院进一步治疗。既往病史无特殊情况。入院体检：体温37.3℃，脉率109/min，呼吸20/min，血压120/80 mmHg。神清，精神可，全身皮肤黏膜无瘀点、瘀斑，双侧下颌下、耳后、右侧腋窝、右侧腹股沟可触及多个大小不等淋巴结(最大3 cm × 2.5 cm)，活动度可，有压痛。牙龈肿胀，咽充血，双侧扁桃体Ⅲ度肿大，无脓性分泌物。颈软，甲状腺不肿大。胸骨无压痛，双肺呼吸音粗，左下肺可闻及少量湿罗音;心率109/min，律齐，心音亢进，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹平软，肝肋下未及，脾甲乙线3 cm，甲丙线4 cm，丁戊线-7 cm。神经系统检查无异常。入院腹部B超检查：胆囊壁见数个扁平隆起，最大1.5 cm × 0.5 cm。肝脾肿大(肝肋下斜径14.7 cm，脾肋下斜径18.9 cm，肋间厚度5.1 cm)。腹膜后多发性肿大淋巴结(最大2.6 cm × 2.0 cm)。胰腺显示不清，双肾未见异常。骨髓细胞形态学(图1)：骨髓增生明显活跃，原始粒细胞占24.8%;嗜酸粒细胞占16.8%，体积较大，胞浆丰富，充满粗大的嗜酸颗粒，并夹杂有不成熟的嗜碱颗粒，未见Auer小体。单核系统异常增生，原始单核细胞占17.2%，幼稚单核细胞占284%。巨核细胞2个，为颗粒巨，血小板少见。POX(图2)：原幼细胞阳性率89%，积168分;PAS(图3)：原幼细胞阳性率71%，积76分。NAE(图4)：原幼细胞阳性率68%，积124分。NAE+NaF(图5)：原幼细胞阳性率24%，积24分。血片：原始粒细胞占11%，原幼单核细胞占40%，血小板少见。

　　细胞遗传学分析

　　治疗前抽取骨髓约5 ml，肝素抗凝，计数后按(1-2)×106/ml进行直接法制备染色体标本，采用R显带技术进行核型分析。染色体核型按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 1995)》[3]进行描述。

　　荧光原位杂交(FISH)检测inv(16)

　　探针MYH11双色探针购自美国Vysis公司，包含16p MYH11基因断裂点两端的序列，两者相距100-150 kb，近端探针用绿色荧光素 (FITC)标记，远端探针用红色荧光(Texas Red)标记。

　　FISH操作步骤按既往报道步骤进行[4, 5]。

　　荧光显微镜检查用配有DAPE/FITC/Texas Red三色滤光片的Leica DRMA2型荧光显微镜观察500个间期细胞。

　　阳性细胞判断标准间期核中可观察到以下3种情况： ①2个红绿毗邻或黄色荧光杂交信号提示inv(16)阴性;②1个红绿毗邻或黄色荧光杂交信号和1红1绿分离存在的两个荧光杂交信号提示inv(16)阳性;③1个红绿毗邻或黄色荧光杂交信号和1个孤立存在的红色荧光杂交信号而丢失1个绿色荧光杂交信号，提示inv(16)同时伴有16p13的微小缺失。

　　流式细胞术检测免疫表型

　　取新鲜骨髓细胞肝素抗凝,制备白细胞悬液,采用CD45 和侧向角散射(SSC) 双参数散点图设门。以直接免疫标记三色荧光检测方法,选择单克隆抗体包括：T 淋巴细胞系列的CD2、CD5、CD7;B 淋巴系列的CD10、CD19、CD20、CD22;髓细胞系列的CD13、CD14、CD15、CD33和CD117和干/祖细胞CD34、HLA-DR。白血病细胞群表面标志检测阳性率≥20%为阳性，CD34、HLA-DR≥10%为阳性。

　　结果

　　细胞遗传学结果： 46,XY[10]。FISH结果： inv(16)阳性占234/250(97.2%)(图6)。免疫表型：原始细胞占18.2%，表达HLA-DR、CD34、CD117、CD33、CD13。异常细胞占49.2%，表达HLA-DR、CD15、CD14、CD33、CD13(图7)。

　　结合骨髓细胞形态学、免疫表型及FISH结果，根据WHO分型[1]确诊为AML-M4Eo伴inv(16)。2005年1月1日予IA方案诱导：第1-第3天去甲氧基柔红霉素(IDA) 12 mg/(m2•d) ，第1-第7天阿糖胞苷(Ara-C) 150 mg/(m2•d)，维持24小时 (CI) 。化疗后浅表淋巴结消退，腹部B超示：胆囊壁隆起消失，脾大(肋下斜径13.4 cm，肋间厚度4.9 cm)，腹腔内未见肿大淋巴结。2005年1月31日复查骨髓：原始粒细胞+原幼单核细胞占1.6%。FISH检测inv(16)： 3/500(0.6%)。流式细胞术检测微小残留病灶(MRD) ： 1.478×10-3。2005年2月2日起予以FLAG方案巩固化疗：第1-第5天氟达拉滨(Flu) 30 mg/(m2•d) (30分钟内滴完)，第1-第5天Ara-C 2 g/(m2•d) (Flu后4小时起，维持2小时)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 300 μg/d。3月14日复查骨髓：原始粒细胞+原幼单核细胞占3.2%。3月21日起行第2次FLAG方案巩固，但3月21 日FISH检测inv(16)： 18/250(7.2%)，考虑存在对FLAG耐药克隆，故第2天即停用，改用IA方案化疗： 第1-第5天Ara-C 1.5 g 每12小时1次，第6-第7天IDA 20 mg。5月8日复查骨髓：原始粒细胞+原幼单核细胞占1.6%。FISH检测inv(16)： 2/500(0.4%)。2005年6月7日予以IA方案化疗： IDA 10 mg 隔日给予×4次，第1-第14天Ara-C 25 mg 每日2次，G-CSF 300 μg/d。8月2日复查骨髓：原始粒细胞+原幼单核细胞占2.0%。FISH检测inv(16): 3/500(0.6%)。8月11日再次予IA方案化疗。化疗过程中多次复查脑脊液正常。

　　讨论

　　伴有inv(16)的AML临床诊断多为M4Eo，但亦可见于其他类型，如M1、M2、M4、M5、M7和CML急性变。此类患者发病年龄小，多为中青年，常有外周血白细胞计数升高，肝、脾、淋巴结肿大，诱导化疗缓解率高等特点。大部分研究表明，该亚型预后较好，对中大剂量Ara-C反应敏感[6, 7]。Razzouk等[8]报道，接受HDAC巩固治疗的患者6年无病生存率(DFS)为(70±15)%，而未接受HDAC治疗的患者只有(11±7)%。法国AML协作组[9]对110例inv(16) AML患者的预后因素进行分析，发现接受含蒽环类药物及Ara-C的诱导治疗完全缓解(CR)率可达93%，CR1期给予中大剂量Ara-C或异体造血干细胞移植(allo-HSCT)，3年总生存率(OS)、DFS和累积复发率分别为58%、48%、42%。接受中大剂量Ara-C和allo-HSCT的患者生存率无显著性差异，故不推荐CR1期进行HSCT。与t(8;21) AML不同，年龄是inv(16) AML唯一的预后不良因素[9]，当年龄<35岁时，患者3年DFS为67%，而>35岁时仅为30%;3年累积复发率分别为29%和55%;3年OS分别为79%和48%，均有显著性差异。而高白细胞计数只降低诱导缓解率，并非是inv(16) AML预后不良的因素。既往报道认为，inv(16) AML患者髓外浸润最易累及中枢神经系统。出现髓外浸润者预后较差， DFS比无髓外浸润者短。但最近有报道认为，髓外病变最易侵犯的是淋巴结腺体，且可能是预后差的指标。Billstrom等[10]通过回顾性研究报道了27例inv(16) AML患者，其中5例(19%)伴有淋巴结腺体浸润，而发生中枢神经系统白血病(CNSL)仅1例复发患者。比较其中18例接受含蒽环类药物及Ara-C的诱导治疗，达CR后均接受过至少1次HDAC化疗的患者，结果显示5例伴有淋巴结腺体浸润患者与13例不伴有淋巴结腺体浸润患者相比，其DFS短，中位DFS仅9个月(不伴有淋巴结腺体浸润的大部分患者仍处于CR1期)。显著淋巴结腺体肿大定义为全身两处以上主要淋巴结区淋巴结肿大>2 cm，在AML中较罕见，目前尚无大样本临床研究。而相关病例报道提示，此类患者缓解后复发率高，预后差[11, 12]，其中有报道发现1例患者复发后转为T-B双表型急性白血病。本例患者确诊为M4Eo，FISH检测inv(16)阳性，伴有显著淋巴结腺体肿大，予IDA和Ara-C诱导缓解后，拟予含HDAC方案巩固化疗。因Ara-C是一种药物前体，在细胞内必须转化成5'-三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)才能发挥抗肿瘤的生物效应，且易被腺苷脱氨酶降解，减低其杀伤肿瘤的活性。Flu系氟化嘌呤类免疫抑制剂，不易被腺苷脱氨酶降解，能保持体内活性，Flu与Ara-C结合可增加Ara-CTP在细胞内的积聚。文献报道，Flu结合Ara-C对白血病的杀伤作用增强，疗效优于中大剂量Ara-C[13]。故本例患者给予FLAG方案巩固化疗。但FISH检测MRD发现FLAG巩固治疗后inv(16)阳性细胞比例增多，说明其对FLAG反应不敏感，疗效欠佳。患者多次脑脊液检查未发现CNSL，亦无其他髓外浸润的证据，淋巴结腺体肿大可能是其预后不佳的标志。目前检测inv(16)的方法包括细胞遗传学、RT-PCR和FISH技术。由于inv(16)是一种微小的染色体异常，细胞遗传学采用显带技术分析时其检出受染色体数量和质量的高度制约，只能在1/3-2/3的病例中检测出inv(16)的异常，特别是R带计数对于检测inv(16)是不敏感的[4]。常规RT-PCR敏感性高，但由于CBFβ-MYH11融合转录本的剪接方式种类较多，采用其中任何一对引物的序列均难以检出所有类别的重排。FISH技术是新发展起来的分子生物学检测手段。与常规细胞遗传学相比，FISH检测不受分裂相数量和质量的影响，敏感性和特异性高，而且能同时检出伴随的16p13微小缺失及t(16;16)( p13;q22)。Mancini等[14]报道，应用16p13 MYH11基因断裂点两侧序列作为探针对inv(16)AML进行双色FISH检测，发现19/19(100%)的常规细胞遗传学有16号染色体异常者FISH结果显示阳性，2例常规细胞遗传学怀疑有inv(16)的病例，FISH显示阴性结果，从而排除inv(16)存在的可能性。复发病例中8/8(100%)FISH检测结果仍为阳性，结果与RT-PCR方法检测结果一致。FISH技术是一种准确可靠的inv(16)检测手段，不但有助于精确的诊断和预后评估，而且是细胞遗传学检查的重要补充，具有重要的临床意义[15, 16]。本例患者常规细胞遗传学监测未发现inv(16)，而FISH技术显示inv(16)阳性，应用FISH技术监测MRD进行预后评估，结果亦较为可靠，准确判断疗效及预测复发。可，FISH比常规细胞遗传学检测更为敏感，不仅可以用于诊断，而且可以用来预测复发。虽然敏感性不如RT-PCR，但可对单个细胞进行检测，因此在检测MRD有重要的应用前景。

　　【参考文献】

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