抗磷脂综合征识别相关抗原的T细胞克隆受体分析

　　作者：欧媛,朱平,朱霞,顾江英,刘静,杜金伟　　作者单位：北京大学第一医院血液研究室， 北京 100034

　　【摘要】为了了解识别抗磷脂综合征相关抗原的T细胞受体特征，用基因谱型图的方法分析一例抗磷脂综合征患者体内的T细胞特征。结果发现： 优势T细胞呈寡克隆性增生;进一步分析2群主要T细胞克隆的T细胞受体(TCR) 基因特征表明，其TCRβ链基因主要由TCRβV8和TCRβV23家族基因编码，T细胞接触抗原的TCRβV CDR3区氨基酸序列分别是： CASSLLVAGGPRAYNEQFFGPG和CASSLAGFGQPQHFGDG，其CDR3区模体YNEQFFGPG和QHFGDG与报道的特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮高度一致。 结论： 这些自身免疫病增殖的T细胞克隆可能识别同样的抗原。

　　【关键词】 抗磷脂综合征,T细胞受体,基因谱型图

　　AbstractTo understand the characteristics of T cell receptors recognizing antiphospholipid syndrome associated antigen, the characteristics of T cells were analyzed using T cell receptor beta variable region (TCRβV) gene spectrotyping in a case of antiphospholipid syndrome (APS). The results indicated that in the case of APS there were 2 dominant T cell clones. The TCRβVs sequences of the 2 T cell clones showed the TCRβVs belonged to 8 and 23 gene families respectively. The peptides of third complementarity-determining regions (CDR3) in the TCRβVs were CASSLLVAGGPRAYNEQFFGPG and CASSLAGFGQPQHFGDG. Comparing the motifs in CDR3 with another autoimmune disease, the motif YNEQFFGPG in TCRβV8 and motif QHFGDG in TCRβV23 were identical with that of idiopathic thrombocytopenic purpura and systemic lupus erythematosus reported before. In conclusion, some T cell clones proliferating in these autoimmune diseases may recognize the same antigens.

　　Key wordsantiphospholipid syndrome; T cell receptor; gene spectrotyping

　　抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome, APS)是抗磷脂抗体(aPL)阳性的自身免疫性疾病。最近发现APS患者体内也存在着异常T细胞克隆 [1]，从患者体内分离出的β2-GPI特异性CD4+ T细胞在aPL的产生中起着重要作用[2]。 Yoshida [3] 等用重组 β2-GPI 体外刺激抗磷脂综合征患者的外周血T细胞得到一群寡克隆增殖的T细胞，其T细胞受体β链可变区(TCR βV)基因利用最多的是βV7和βV8 家族，这些 TCRβ链有可能作为靶标对APS患者进行T细胞水平的免疫治疗。我们用基因谱型图的方法[4]分析了一例主要表现为反复下肢静脉血栓和抗心磷脂抗体阳性的抗磷脂综合征患者的TCRβV的基因利用情况，发现其接触抗原的TCRβV模体与我们以往报道的特发性血小板减少性紫癜[5]和系统性红斑狼疮[6]一致，表明这些自身免疫病中增殖的某些T细胞克隆可能识别同样的抗原。

　　材料和方法

　　病例及标本采集

　　患者女，42岁，因“纳差3个月，腹胀2个月，双下肢浮肿1个月”，于2004年6月14日收入院。查体： 心率96次/分，血压： 12.0/8.0 kPa(90/60 mmHg)，慢性病容，面容稍浮肿，睑结膜略苍白。心肺检查未见异常。腹饱满，触软，肝未触及，脾肋下4 cm，移动浊音可疑阳性。双下肢见对称性可凹性水肿。B超显示肝硬化、脾大、门静脉高压。实验室检查显示：红细胞数3.75×1012/L，大小不均，血沉77 mm/h;总蛋白(TP)48.6 g/L，白蛋白(Alb)17.7 g/L, 这些数值均低。血浆凝血酶原时间(PT)52.6秒，血浆纤维蛋白原(FIB)1.93 g/L，纤维蛋白降解产物(FDP)320 mg/L，血浆D-二聚体(D-dimer)5.18 mg/L, 这些数值均高。三次查抗心磷脂抗体均显示>120 Ru/ml(参考值为<20 Ru/ml)，狼疮抗凝物(LA)阴性。抗磷脂综合征的诊断符合国际工作组提出的诊断标准[7]。取患者外周血2 ml ，EDTA抗凝，Ficoll液(密度1.077)分离单个核细胞，按本室常规方法提取总RNA。用六聚体随机引物及M-MLV反转录酶试剂盒(Promega)反转录合成cDNA 。

　　TCRβV区的PCR扩增

　　利用引物设计软件，根据TCRβV 24个基因家族设计家族特异性上游引物，其中βVl0，βVl9是假基因不用，βV5，βV13分别包括βV5.l, βV5.2和βV13.1，βV13.2,在TCRβ链C区设计一个通用的下游引物。PCR反应总体系为25 μl,其中含有l μl逆转录产物，10×PCR 缓冲液2.5 μl，MgCl2终浓度为1.5 mmol/L， dNTP (10 mmol/L)0.5 μl， 5 pmol家族特异性引物，1 U的Taq酶，反应体系经过94℃变性5分钟后直接进人PCR循环，退火温度为55℃，共38个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物-20℃保存。

　　PCR产物的基因谱型图分析

　　PCR产物进行普通6%聚丙稀酰胺凝胶电泳(室温，恒压200 V，约1小时)，银染法观察产物条带各自所处的位置，选择几个明显浓染的条带，将其产物进行4.5%测序胶电泳、银染。具体操作如下： 采用4.5%的尿素变性聚丙稀酰胺凝胶长泳道电泳分离PCR产物，上样缓冲液中含有去离子甲酰胺，将上样缓冲液与产物6 μl按1∶1混合，上样前94℃变性10分钟，立即置于冰上以保持产物的变性状态等待上样。电泳条件为1 400 V恒压，60℃持续4小时。用含四氢硼化钠作为还原剂的特殊银染法显示分离条带。

　　优势克隆的TCRβV测序

　　从4.5%凝胶上割下染色明显浓集的单一条带，用20 μl TE反复冻融3次，4℃浸泡24小时。取1 μl作为模版，用相应的上述引物扩增TCRβV区，PCR体系为50 μl，各组分浓度不变，条件同上。产物进行2%琼脂糖电泳，按本室常规玻璃奶纯化后由北京华大生物技术有限公司测序。测序结果在www.ncbi.nlm.nih.hob/blast中进行相似性比较。

　　结果

　　T细胞优势克隆TCRβV8和TCRβV23基因家族表达的基因谱型图分析

　　普通6%聚丙稀酰胺凝胶电泳条带显示TCRβV24个家族中，βV8和βV23家族在约267 bp分子量标志处可见浓染条带(图1),βV8家族有杂带, βV8和βV23家族通过类似SSCP的4.5%测序胶再次电泳后可得单一浓集条带(图未显示)。选择βV8和βV23两个条带测序。

　　TCRβV8和TCRβV23测序和CDR3区分析结果

　　TCRβV8测序结果共241个碱基，GenBank登记序列号DQ294631，将基因序列翻译为TCRβV8，其多肽序列： SGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRD SAVYFCASSLLVAGGPRAYNEQFFGPGTRLTVLEDLK NVFPPEVAVFEPSE。 CDR3区为： CASSLLVAGGPRAYNEQFFGPG。 在http://geno3d-pbil.ibcp.fr/网址做TCRBV8 CDR3结合抗原肽序列比较，结果见图2A，它包含了TCRBV8 CDR3区和部分框架区，左下角方框内突出的部分为CDR3与抗原肽的结合区。

　　TCRβV23测序结果共256个碱基，GenBank登记序列号DQ294632，将基因序列翻译为TCRβV23： QGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYH SELNMSSLELGDSALYFCASSLAGFGQPQHFGDGTRL SILE。 其CDR3区为： CASSLAGFGQPQHFGDG。 在http://geno3d-pbil.ibcp.fr/网址做TCRBV23 CDR3结合抗原肽序列比较，结果见图2B，仅显示TCRBV23的CDR3区，方框内为抗原肽结合区。

　　APS的TCRβV CDR3区上的模体与以往报告的特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮的TCR模体一致

　　TCRβV8模体NEQFFGPG和我们报道的特发性血小板减少性紫癜[5]18个序列中的2个、系统性红斑狼疮[6]10个序列中的6个完全一致。而TCRβV23模体QHFGDG和特发性血小板减少性紫癜的18个序列中的1个[5]完全一致,表明这些自身免疫病中增殖的T细胞克隆可能识别同样的抗原。

　　讨论

　　抗磷脂综合征是一组与抗磷脂抗体相关的自身免疫性疾病，主表现为反复动静脉血栓、习惯性流产和血小板减少,诊断主要依据临床表现和实验室检查。目前公认抗磷脂综合征患者体内起关键作用的主要是一组针对β2-glycoprotein I(β2-GPI)和凝血酶原(prothrombin)的抗体，包括抗磷脂抗体(aPL)和狼疮抗凝物(LA)，但发病机制尚不明确。已经发现可能还和针对磷脂结合蛋白的T细胞免疫反应有关[8]。Yoshida等[3] 等用重组 β2-GPI 体外刺激抗磷脂综合征患者的外周血T细胞得到一群寡克隆增殖T细胞，用聚合酶链反应和单链构相多态性(PCR-SSCP)的方法进一步分析这些寡克隆T细胞的T细胞受体β(TCRβ)链的利用情况，发现TCRβ的基因利用有一定的限制性，利用最多的是βV7和βV8 家族。本研究的病例主要表现为反复下肢静脉血栓，无习惯性流产和血小板减少，aPL阳性，体外凝血功能异常，LA阴性，并且血清中有单克隆免疫球蛋白IgMκ，血免疫球蛋白IgM升高，说明体内有一群自身反应性优势B细胞克隆产生了抗体，但是否同时出现T细胞免疫紊乱并不清楚。我们用基因谱型图的方法分析了患者体内的T细胞特征，发现有优势T细胞寡克隆增生，进一步分析了2群优势T细胞克隆的T细胞受体(TCR) 基因特征，其TCRβ链基因利用也有一定限制性，主要利用的是TCRβV8和TCRβV23基因家族。Yoshida等 [3] 得到的寡克隆增殖的T细胞βV7+ TCR的第三互补决定区(CDR3)都共用模体TGxxN/Q，而βV8+ 的TCR CDR3区则共用模体PxAxxD/E， 但是这些模体氨基酸序列变异似乎太大，没有完全的一致性。我们分析T细胞克隆的TCRβV8和TCRβV23基因，确定其接触抗原的TCRβV CDR3区氨基酸序列分别是： CASSLLVAGGPRAYNEQFFGPG和CASSLAGFGQP-QHFGDG，对其模体YNEQFFGPG和QHFGDG经互连网查询后未发现与基因库中存储的其他人报告的自身免疫病相关的TCR有相同者，本研究中的序列已在GenBank中申请了序列号DQ294631和DQ294632。将这两个序列与我们报道过的特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮中克隆性增殖的特异性T细胞受体序列比较后发现，TCRβV8模体NEQFFGPG与特发性血小板减少性紫癜18个序列中的2个[5]、系统性红斑狼疮10个序列中的6个[6]相同，而TCRβV23模体QHFGDG则和特发性血小板减少性紫癜18个序列中的1个[5]相同。抗磷脂综合征、特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮这三种疾病的发生都与自身抗原有关，患者体内出现了针对自身抗原的细胞免疫紊乱，有寡克隆的T细胞增殖。我们的研究发现，这些占优势的T细胞克隆其TCR上与抗原接触的CDR3区模体有一致性，提示这些自身免疫病中增殖的T细胞克隆可能识别相同的抗原。这些 TCRβ 链有可能作为靶标用于APS或具有相同自身抗原的自身免疫病患者T细胞水平上的免疫治疗。

　　【参考文献】

　　1 Visvanathan S， McNeil HP. Cellular immunity to beta 2-glycoprotein-1 in patients with the antiphospholipid syndrome. J Immunol, 1999; 162: 6919-6925

　　2 Kuwana M， Autoreactive CD4(+) T cells to beta (2)-glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. Autoimmunity Reviews， 2003; 2: 192-198

　　3 Yoshida K, Arai T, Kaburaki J, et al. Restricted T-cell receptor beta-chain usage by T cells autoreactive to beta(2)-glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. Blood, 2002; 99: 2499-2504

　　4 朱霞，郭晓玲，朱平. 用TCRβ链可变区谱型图分析疾病中T淋巴细胞克隆的变化. 中国实验血液学杂志, 2005; 13：703-708

　　5 朱霞，朱平，郭晓玲. 慢性血小板减少性紫癜相关T细胞克隆的T细胞受体特征. 中华医学杂志, 2005; 85: 3316-3322

　　6 符粤文，朱平，赵晓武等. 系统性红斑狼疮自体外周血干细胞移植T细胞谱型变化. 中华医学杂志, 2003; 83：1648-1652

　　7 Wilson WA, Gharavi AE, Koike T, et al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome: report of an international workshop. Arthritis Rheum, 1999; 42:1309-1311

　　8 Cuadrado MJ, Lopez-Pedrera C. Antiphospholipid syndrome. Clin Exp Med, 2003; 3:129-139

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号： 39970131, 30470739);北京市自然科学基金资助项目(编号： 7032028)