3，6二羟黄酮对HL60细胞生长增殖的影响

　　作者：李春梅,刘新光,梁念慈　　作者单位：广东药学院生物化学与分子生物学教研室，广东广州 510006; 广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江　524023

　　【摘要】目的 观察3，6二羟黄酮对HL60细胞的影响。方法 分别用台盼蓝拒染观察药物对细胞的毒性作用，流式细胞术、Hoechst 33258/PI荧光双染和琼脂糖凝胶电泳观察药物对细胞周期的影响以及凋亡情况。结果 3，6二羟黄酮对HL60细胞具有明显地细胞毒作用，呈一定的时效性;流式细胞术、荧光双染和琼脂糖凝胶电泳实验，发现了典型的凋亡细胞，且随药物浓度的增加，凋亡细胞数明显增加;然而统计学分析发现3，6二羟黄酮并没有引起HL60细胞周期的变化。结论 3，6二羟黄酮能明显地抑制HL60细胞的增殖，并能引起细胞的凋亡。

　　【关键词】 3，6二羟黄酮,HL60细胞株,凋亡

　　【Abstract】 Objective To observe effect of 3,6dihydroxyflavone on the proliferation of HL60 cell lines.Methods The effect of 3,6dihydroxyflavone on the proliferation of HL60 cell lines was detected by Trypan blue dye exclusion assay, the changes of the cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM), the apoptosis was analyzed by FCM, Hoechst 33258/PI fluorescence staining and DNA agarose gel electroporesis.Results 3,6dihydroxyflavone had strong cytotoxicity to HL60 cell lines with dependence of time, While abnormality of cell cycles could not be induced. After treated with 3,6dihydroxyflavone for 36h, HL60 cell line could be induced apoptosis, which was confirmed by FCM,fluorescence staining and DNA agrose gel electroporesis.Conclusion Conclusion 3,6dihydroxyflavone could strong inhibit the proliferation of HL60 cell lines and could induce apoptosis.

　　【Key words】 3,6dihydroxyflavone;HL60 cell lines;apoptosis

　　白血病是一种血液恶性肿瘤，白血病细胞丧失分化、成熟的能力以及异常增殖，致使恶性细胞在体内积累。白血病对人体有极大的危害，发病率较高，为2.76/10万，白血病的治疗在当今世界上仍是一大难题。有关3，6二羟黄酮(化学结构见图1)与肿瘤细胞关系的报道很少，仅有学者研究了它对几种不同的细胞周期的影响[1]，发现30 μmol/L 的3，6二羟黄酮能升高SF295、SKOV3、HCT15、HCT15/CL02等多种癌细胞株S期细胞数。本实验首次在体外观察3，6二羟黄酮对人早幼粒白血病细胞株HL60生长增殖的影响，并探讨其抗肿瘤作用与细胞凋亡的关系。

　　图1 3，6二羟黄酮的化学结构(略)

　　材料与方法

　　1.材料 3，6二羟黄酮购于美国Aldich公司;人早幼粒白血病细胞株HL60为广东医学院生化所保存;RPMI1640购于美国Gibco公司;新生小牛血清购于杭州西季青生物公司;PI、EB、RNase A、Hoechst 33258均购于美国 Sigma公司;其余为国产分析纯产品。

　　2.细胞培养 人早幼粒白血病细胞株HL60培养于含有10%灭活的小牛血清、100U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱孵育，取对数生长期细胞实验。

　　3.药物的配制 用DMSO配成原液，分装冻存，临用前用DMSO稀释成所需浓度。药物作用于细胞时，DMSO的终浓度等于0.1%(v/v)，实验表明该浓度对细胞生长增殖无影响。

　　4.台盼蓝拒染法检测3，6二羟黄酮对HL60细胞生长增殖的影响 参考文献[2]收集对数生长期的细胞，PBS洗3次，调整细胞浓度0.5×105～1.0×105/ml，分装于24孔板，每孔1 ml，加入1 μl不同浓度药物，每组设4个平行孔，并设空白对照孔。细胞加药后置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱培养，加入台盼蓝染色，用台盼蓝拒染法在镜下计活细胞数，按下式计算不同浓度的药物对细胞的生长、增殖抑制率(IR)。抑制率(Inhibitory rate，IR)=(1用药组活细胞数/空白组活细胞数)×100%;按改良Karber公式计算IC50：

　　IC50=XmI×(P-3PmPn4)

　　【其中I=log(最大剂量/相邻剂量);Xm=log最大剂量;P=阳性反应率之和;Pm=最大阳性反应率;Pn=最小阳性反应率】

　　5.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡细胞 参照文献[3]，略有改动。分别收集不同浓度药物处理的细胞1.0×106，PBS洗3次，用70%(v/v)的冷乙醇4℃固定过夜。上机前收集细胞，用PBS洗涤细胞除去乙醇，用碘化丙啶(PI)染液(含20 μg/ml PI，0.25 μg/ml RNase A)，室温染色30 min。过滤，流式细胞仪(FCM)检测，资料经LysisⅡ收集、贮存、分析。

　　6.荧光染色 参照文献[4]，略有改动。收集对数生长期的细胞，PBS洗3次，调整细胞浓度2.0～3.0×105/ml，加入6孔板中，加入不同浓度的药物，并设空白对照组，处理一定时间后，收集细胞，加入荧光染料Hoechst 33258和PI，至其终浓度分别为10 μg/ml和20 μg/ml，37℃避光染色30 min，紫外光激发，荧光显微镜下观察细胞核的形态及颜色改变以区分出正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并拍照。

　　7.琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段化 参照文献[5]，略有改动。收集107细胞，PBS洗涤离心沉淀细胞，用50μl裂解液(1%NP-40、20 mmol/L EDTA、50 mmol/L TrisHCl pH=7.5)处理细胞10 s，1 500 g离心5 min，收集上清液，再用50 μl裂解液重复处理1次，合并上清液，加10%SDS，2 μl 10 mg/ml RNase A，混匀，37℃水浴2 h，加入4 μl 20 mg/ml 蛋白酶 K于56℃处理2 h，加入70 μl 10 mmol/L NH4Ac，600 μl无水乙醇沉淀DNA， 4℃，15 000 g，离心15 min，真空干燥，TE Buffer溶解DNA，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳(恒压)，观察并拍照。

　　8.统计学处理 计量资料以-±s表示，采用SPSS 11.0进行单因素方差分析，P<0.05为有统计学差异。

　　结果

　　1.台盼蓝拒染法检测药物的细胞毒性作用 不同浓度的3，6二羟黄酮分别作用于人早幼粒白血病细胞株HL60不同时间，用台盼蓝拒染法观察它的增殖抑制效果。结果表明(见表1)：当时间不变时，随着3，6二羟黄酮剂量的增大，对HL60细胞株抑制作用增强，且呈剂量依赖性;在同一药物浓度情况下，随着药物作用时间的延长，药物对细胞株增殖的抑制作用也有所增强，呈时间依赖性。当0～160 μmol/L的3，6二羟黄酮分别处理细胞12 h、24 h和36 h，计算其半抑制浓度IC50值分别为166.79 μmol/L、59.01 μmol/L、22.94 μmol/L。选择36 h作为后续研究的作用时间。

　　表1 3，6二羟黄酮对人早幼粒白血病细胞株HL60的细胞毒性作用(略)

　　注：与0 μmol/L组比较，※P<0.05，※※P<0.01

　　2.流式细胞仪检测结果 当细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶激活使DNA广泛降解、断裂，DNA结构发生剧变，细胞内总DNA量降低。流式细胞仪(FCM)可以检测凋亡时DNA的这种结构及量的变化，于正常G0/G1细胞期前出现一DNA低染细胞群，称“A0细胞群”即凋亡细胞群。当药物浓度在0～160 μmol/L范围内，3，6二羟黄酮作用HL60细胞36　h，对细胞周期无明显影响(P均>0.05)，却能导致HL60细胞的明显凋亡，当药物浓度为40 μmol/L时，开始出现凋亡峰，凋亡率为2.5%，当药物浓度达160 μmol/L时，凋亡率达38.5%(见图2及表2)。

　　A：对照 B：10 μmol/L C：40 μmol/L D：160 μmol/L

　　图2 3，6二羟黄酮作用HL60细胞36 h后流式细胞仪分析图谱(略)

　　表2 3，6二羟黄酮作用HL60细胞36 h对细胞周期的影响(略)

　　3.荧光染色结果 凋亡细胞细胞膜通透性有所增加，因此，药物处理后的细胞经Hoechst 33258/PI双重染色后，外形不规则被染成红色荧光的细胞为坏死细胞;细胞体积缩小而完整，被染成亮蓝色的是凋亡细胞;而正常活细胞对染料有拒染性，细胞核成均匀弥散浅蓝色荧光。荧光双染结果(见图3)显示，3，6二羟黄酮处理过的HL60细胞，可以见到典型的凋亡细胞，且随着药物浓度的增加，凋亡细胞数目明显增加。

　　A：对照 B：10 μmol/L C：40 μmol/L D：160 μmol/L

　　图3 3，6二羟黄酮作用HL60 36 h经Hoechst 33258/PI染色荧光显微镜下观察图谱(×200)(略)

　　4.DNA断裂的凝胶电泳图谱分析 凋亡的主要生化标志是内源性钙镁离子依赖性核酸内切酶被激活，导致细胞DNA广泛断裂，形成大小不一的DNA片段，从而在琼脂糖电泳上呈现规则的、间隔180～200碱基对的“DNA梯”。图4显示不同浓度的3，6二羟黄酮作用HL60的DNA断裂的凝胶电泳图谱，当药物浓度较低时，未出现“梯”，且在同一分子量位置出现了分子量较大的一条带，表明未发生凋亡，也可能是由于发生凋亡的细胞数未达到出现“DNA梯”的细胞数;随药物浓度的增加，“梯”现象更加明显。

　　图 4 3，6二羟黄酮处理HL60细胞株36 h DNA断裂凝胶电泳图谱(略)

　　A：对照　B：10 μmol/L C：40 μmol/L D：160 μmol/L M：100bp DNA marker

　　讨论

　　肿瘤的形成是基因调控的细胞增殖失控、分化异常和(或)细胞凋亡过程受到抑制两方面共同作用所致。因此，诱导肿瘤细胞凋亡对肿瘤的发生发展机制的研究及其治疗，都具有十分重要的意义。由于抑制细胞增殖的可能机制主要有三种：一是引起细胞的死亡(包括凋亡);二是引起细胞周期各时相的等比例延长;三是细胞被阻滞在周期中的某一个时相。为探讨3，6二羟黄酮对HL60细胞的影响情况，本实验采用了台盼蓝拒染法和流式细胞术等方法。结果发现：3，6二羟黄酮对HL60细胞有明显的细胞毒作用，呈一定的时效性;流式细胞术和Hoechst33258/PI荧光双染实验，均发现典型的细胞凋亡现象，且随药物浓度的增加，凋亡细胞数明显增加;然而统计学分析显示3，6二羟黄酮并没有引起HL60细胞周期的变化。提示3，6二羟黄酮对HL60细胞的细胞毒作用，可能主要是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的。此外，3，6二羟黄酮能提高细胞核酸内切酶的活性，从而使其DNA电泳图谱上观察到明显的ladder出现。

　　凋亡是细胞受到某些因素刺激后一种主动的由凋亡相关基因调控的“自杀”过程，亦称细胞程序性死亡，是细胞在其分裂、增殖、分化和衰老死亡中具有十分重要作用的生物学现象。它在维持细胞内环境稳定，维持机体的正常发育和组织状态有重要意义。生理性细胞凋亡机制紊乱将导致发育异常和加速肿瘤发生和恶化。故有人提出肿瘤生长的主要原因不是肿瘤细胞受刺激大量增殖的结果，而是细胞凋亡抑制剂和肿瘤促进剂等延长了已转化的细胞生存期限的结果。促进和诱导细胞凋亡是治疗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药的一种新思路，也是当今抗肿瘤研究的热点之一。

　　本文从DNA片段化分析，细胞形态学分析证明3，6二羟黄酮具有诱导HL60细胞凋亡的作用，但有关其诱导凋亡的具体机制未清。然而，本课题组实验证明3，6二羟黄酮在胞外能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性[6]，但是却对细胞内CK2活性没有明显的影响(数据未列出)，因此其诱导HL60细胞凋亡的机制可能与胞内CK2的活性无关，怀疑可能与CK2在细胞内的核定位有关。有些研究表明[7]：CK2的亚细胞定位是高度动态的。Guo等[8]提出，一些化学诱导的凋亡可能引起细胞核基质内CK2活性的升高，这可能是因为CK2从胞质中被转运到核间隔中，CK2穿梭到核基质可能是对化学诱导的凋亡的一种保护性行为。转染了CK2α基因的细胞能明显抑制化学诱导的凋亡，而相应的核基质内的CK2有所升高，因而他们提出CK2在抑制细胞凋亡方面发挥了作用。2001年1月在智利召开的第三届蛋白激酶CK2国际会议上，更是进一步提出CK2有抑制细胞凋亡的功能。接着，Pinna实验室[9]又证实了目前最特异的CK2抑制剂TBB，能诱导Jurkat细胞的凋亡。另外，这可能与凋亡基因Capse家族有关(Caspse家族是CK2的底物之一)。有研究发现，CK2的抑制剂——槲皮素、芹黄素、杨梅黄酮能够通过刺激Caspse3和Caspse9的活性而诱导HL60细胞的凋亡[10]。相信，随着研究的进一步深入，将对指导临床对白血病的治疗产生重要的现实意义。

　　【参考文献】

　　[1]Choi SU,Ryu SY，Yoon SK，et al. Effects of flavonoids on the growth and cell cycle of cancer cells[J]. Anticancer Res,1999,19(6B):5229-5233.

　　[2]韩 锐. 抗癌药物研究与实验技术(修订本)[M].北京:北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社，1975，281-282.

　　[3]Nicoletti I,Migliorati G,Pagliacci MC,et al.A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry[J].J Immunol Methods,1991,139(2):271-279.

　　[4]Darzynkiewicz Z,Bruno S,Del Bino G,et al.Traganos F.Features of apoptotic cells measured by flow cytometry[J].Cytometry,1992,13(8):795-808.

　　[5]Herrmann M,Lorenz HM,Voll R,et al.A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments[J].Nucleic Acids Res,1994,22(24): 5506-5507.

　　[6]李春梅，刘新光，林小聪，等. 3，6二羟黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析[J].中国药学杂志，2004，39(12)：903-906.

　　[7]Montenarh M.Protein kinase CK2:in search for its regulation[J].Adu Clin Exp,2003,12：15-22.

　　[8]Guo C,Yu S,Davis AT,et al.A potential role of nuclear matrixassociated protein kinase CK2 in protection against druginduced apoptosis in cancer cells[J].J Biol Chem,2001,276(8):5992-5999.

　　[9]Ruzzene M,Penzo D,Pinna LA.Protein kinase CK2 inhibitor 4,5,6,7tetrabromobenzotriazole (TBB) induces apoptosis and caspasedependent degradation of haematopoietic lineage cellspecific protein 1(HS1) in Jurkat cells[J].Biochem J,2002,364(Pt 1):41-47.

　　[10]黄华艺，查锡良.黄酮类化合物抗肿瘤作用研究进展[J]. 中国新药与临床杂志,2002,21(7)：428-433