急性髓系白血病中Nras基因点突变的检测以及信号传导通路蛋白的表达

　　作者：杨建刚,孙雪梅,顾香芳,徐祖琼　　作者单位：1.东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009;2.南京大学医学院附属南京鼓楼医院血液科，江苏 南京 210008

　　【摘要】目的 研究Nras基因在急性髓系白血病(AML)中的突变以及在AML和正常对照组中RAS蛋白下游信号传导通路上AKT、ERK1/2以及其活化形式PAKT和PERK1/2的表达情况。方法 应用聚合酶链反应单链构象多态性法(PCRSSCP)及直接测序法检测AML中Nras基因突变率，应用Western blot法检测AKT、ERK以及其活化形式PAKT,PERK1/2的表达量。结果 48例AML中检测到2例Nras 12突变，2例Nras 61突变，突变组PAKT、PERK1/2的表达水平较正常对照组明显升高(P<0.05)。未有Nras基因突变的AML其PAKT、PERK1/2的表达水平也增高，但表达不均一。结论 Nras基因突变可能是AML发生发展的原因之一，其机制可能是由于突变导致编码的Ras蛋白构型改变，使其处于功能持续活化状态，从而激活了Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt等下游信号传导通路，最终导致AML的发生。

　　【关键词】 Nras基因,急性髓系白血病,突变;PAKT;PERK

　　Abstract：Objective To study the mutation rate of Nras gene in acute myelocytic leukemia (AML) and the effect of Nras gene on the RAS protein downriver signal conduction circuit AKT,ERK1/2 and its activation form PAKT and the PERK1/2 expression in AML and the normal group.Methods Polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism(PCRSSCP) and direct sequencing of AML were utilized to detect Nras gene mutation rate.Western blot was employed to detect AKT,ERK and PAKT,PERK1/2 expression levels.Results In 48 patients with AML,two cases of Nras 12 mutation were detected,as well as two cases of Nras 61 mutation.In the mutation group,PAKT,PERK1/2 expression levels increased significantly than normal control group(P<0.05).In the cases of AML with no Nras gene mutation,the expressions of PAKT,PERK1/2 also increased,but not to the uniform extent.Conclusion Nras gene mutation may play a role in the development of AML;It causes the mutations in the Ras protein coding gene,leading to structure changes and constitutive activation of Ras protein.Activated Ras protein then activates Raf/Mek/Erk and PI3K/Akt downstream signal transduction pathways,eventually leading to the incidence of AML.

　　Keywords:Nras gene;acute myelocytic leukemia;mutation;PAKT;PERK

　　越来越多的研究表明，急性髓系白血病(AML)的发病与基因突变有关，其突变过程由多步骤完成，目前已经得到公认的是二次打击学说。这些多步骤基因改变往往最终归结到共同的信号转导和转录途径，如Ras信号转导途径就在AML的发病中起了重要作用，因此针对Ras信号转导途径的靶向治疗成为了研究热点。目前存在的问题是Ras信号途径有复杂的网路调控，具体的调控机制还有待进一步的研究阐明。Ras基因家族有3个结构类似的成员，即Hras、Kras和Nras，其中和AML发生相关的主要是Nras基因[1]，基因全长85 kb，其cDNA长约2.1 kb，是一个编码含495个氨基酸的蛋白，称为p21Ras，p21是一种膜结合G蛋白，参与信号传导途径，当Ras蛋白接受信号刺激或自身突变活化后，主要通过刺激Raf/Mek/Erk增殖和PI3K/Akt抗凋亡两条途径上的蛋白磷酸化来发挥作用，导致AML的发生[2]。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源

　　检测2005至2007年在鼓楼医院血液科就诊的初诊AML患者48例，男30例，女18例，年龄13～76岁，其中4例M1，12例M2，11例M3，9例M4，7例M5，3例M6，2例M7。正常对照组18例，均为同期就诊的特发性血小板减少性紫癜患者及正常供髓者。另外培养HL60细胞作为阳性对照，K562细胞作为平行对照。

　　1.2 实验试剂

　　Nras 12引物是atg act gag tac aaa ctg gt和tct atg gtg gga tca tat t，Nras 61引物是caa gtg gtt ata gat ggt ga和agg aag cct tcg cct gtc ct[3]，均由上海生工生物工程公司合成。用购自Promega公司的Genomic DNA purification kit 提取样品DNA。使用TaKaRa的PCR试剂盒行PCR。AKT兔抗多克隆抗体和PAKT兔抗单克隆抗体、内参GAPDH为上海康成生物工程公司产品;ERK1/2、PERK1/2兔抗多克隆抗体以及二抗(抗兔，带辣根过氧化物酶标记)购自CELL SIGNALING公司。ECL显色液购自SANTA CRUZ生物技术公司。HL60细胞株为上海细胞生物研究所赠与。胎牛血清购自Promega公司。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 标本采集 用预先肝素化的无菌注射器取AML患者及对照组骨髓液3～5 ml,使用淋巴细胞分离液(Ficoll液)分离骨髓单个核细胞(MNC),保存于-70 ℃或者直接提取DNA和蛋白。HL60及K562细胞株待培养到稳定对数生长期，分别取1×107数量级的细胞提取DNA和蛋白。

　　1.3.2 PCRSSCP法 PCR反应总体积为50 μl体系，含有TaKaRa Taq酶0.25 μl,10×PCR Buffer 5 μl,Mgcl2(25 mmol•L-1)3 μl,DNTP Mixture(各2.5 mmol•L-1)4 μl,模板DNA4 μl,引物(20 U)各1 μl,加灭菌蒸馏水至50 μl。反应条件为：(1)94 ℃预变性10 min，(2)依次94 ℃变性60 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环。(3)72 ℃延伸10 min。产物置于4 ℃保存。PCR产物10 μl加入变性缓冲液(95%甲酰胺，10 mol•L-1 medta,0.02%溴酚蓝)10 μl，加热煮沸6 min，立即置于冰浴中冷却至少5 min。然后上样12%PAGE胶(含10%甘油，0.5×TBE),4 ℃层析柜中300 V电泳5 min，120 V电泳8～10 h，溴化乙锭染色，照像分析。

　　1.3.3 DNA测序 经PCRSSCP法检测有异常的条带样品，其PCR产物送到Invitrogen公司测序验证是否存在突变，同时明确突变位点。

　　1.3.4 Western blot法 用适量含磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解已分离的骨髓单个核细胞和HL60及K562细胞，提取蛋白，用Bradford法测定每个样品的总蛋白含量，加入4×样品缓冲液，煮沸6 min，每孔加入相同量的样品总蛋白，10%SDSPAGE分离后，电转于PVDF膜，分别用兔抗AKT和ERK1/2多克隆抗体、兔抗PAKT单克隆抗体、兔抗PERK1/2、兔抗多克隆抗体以及内参兔抗GAPDH,兔抗二抗进行Western印迹分析，ECL系统显色。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增Nras基因

　　AML组及正常对照组骨髓DNA经Nras基因第1外显子上、下游引物引导扩增后,琼脂糖凝胶观察出现大小为110 bp的片段,见图1。

　　2.2 Nras 12,13,61位点突变分析

　　检测AML组Nras 12，13，61位基因突变采用PCRSSCP(聚合酶链反应单链构象多态性)法。48例AML患者中共检测到Nras 61位点突变2例，Nras 12/13位点突变2例。总突变率是8.33%,Nras 61和Nras 12/13突变率均为4.17%。另外在18例对照组中，未检测到有Nras基因突变。HL60细胞株有Nras 61位点突变。见图2。图2显示，4、9泳道比其他泳道泳动速度快，6～8是正常阴性对照组，9是HL60细胞株为阳性对照组，可见4号泳道可能存在Nras基因突变。

　　将检测到有Nras基因突变样本的PCR扩增产物经纯化后送上海生工生物工程公司测序，因PCR扩增片段较短，仅110 kb，测序未成功。

　　2.3 AKT、ERK1/2和PAKT和PERK1/2表达

　　将总样本48例(AML组)和18例(正常对照组)分成A、B、C 3组，其中A组为AML伴Nras基因突变组(4例)，B组为AML不伴Nras基因突变组(44例)，C组为正常对照组(18例)，分别用Western Blot法检测信号传导通路Raf/Mek/Erk、PI3K/Akt上ERK1/2、AKT蛋白以及其活化形式PAKT、PERK1/2和内参GAPDH的表达，结果见图3、4。然后应用Gelpro Analyzer 4.0软件分别测得AKT、ERK1/2、PAKT和PERK1/2的光密度，再除以内参GAPDH的光密度后得到各样本值，应用SPSS 11.5统计软件进行单因数方差分析。结果见表1。表1 各组AKT、ERK1/2、PAKT和PERK1/2表达水平比较

　　与C组比较，*P<0.05;与组内AKT/GAPDH比较，#P<0.05;与组内PERK/GAPDH比较，△P<0.05表1结果显示，A、B两组间AKT/GAPDH、PAKT/GAPDH、ERK/GAPDH、PERK/GAPDH比较，A组比B组稍高，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。A、B两组与C组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。另外A、B两组内比较，PAKT/GAPDH、PERK/GAPDH表达水平分别比AKT/GAPDH、ERK/GAPDH要低，差异有统计学意义(均P<0.05)

　　3 讨 论

　　目前认为AML多由几个基因联合致病，著名的“二次打击”认为，Ⅰ类突变导致增殖/存活优势(包括BCRABL,TELPDGFRB,FLT3和Ras等基因突变)，Ⅱ类突变导致分化受阻(包括PMLRARA、RUNX1ETO等基因突变)[4]，可见Ras基因突变是导致AML发生的重要原因之一。Tayler等[5]研究表明，AML发病与Ras基因突变之间存在密切关系，约15%～30%的AML患者有Nras和Kras基因突变，而在正常人群中Ras的自然突变几乎检测不到。Bowen等[6]在年龄小于60岁AML患者的大样本研究中发现，大约11%(126/1 106)的患者存在Nras突变。

　　本研究中AML患者Nras基因总突变率比国内外报告稍低，考虑可能与PCRSSCP检测的敏感性有关，以后可考虑采用多种方法检测以提高检测率。另外国外[7]报道Nras基因突变中主要以Nras 12/13基因位点突变为主，而本研究中Nras 61与Nras 12/13位点突变各检测到2例，Nras 12/13位点突变占总突变的比例稍低，考虑可能与检测样本量较少有关。

　　另外在18例对照组中，未检测到Nras基因突变，表明AML发病与Nras基因突变间存在密切关系，因此认为Nras基因突变是导致某些AML发生的重要原因之一。

　　AKT和ERK1/2分别是细胞增殖途径Raf/Mek/Erk和抗凋亡途径PI3K/Akt上两个重要信号传导通路蛋白，它们在体内一系列重要生物学效应中起重要作用，一旦因为某种原因其蛋白被磷酸化，则会处于持续激活状态，导致多种恶性疾病的发生[8]。

　　本实验中，在AML伴或不伴Nras基因突变组，AKT、ERK1/2、PAKT和PERK1/2蛋白表达量较正常对照组均有明显增高，其中AML伴Nras基因突变组增高更明显。据此推测Nras基因突变后导致RAS蛋白构型改变，RAS蛋白持续活化，导致增殖途径Raf/Mek/Erk和抗凋亡途径PI3K/Akt持续激活，从而引起AML发生。而在AML不伴Nras基因突变组AKT、ERK1/2、PAKT和PERK1/2蛋白表达量也较正常对照组有明显增高，考虑是因为AML的发生是由几个基因联合致病的，而多种原因(如Ckit基因突变，PI3K p110d的上调，PTEN的磷酸化或下调等)都可以引起Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt途径的持续激活，导致AKT、ERK1/2、PAKT和PERK1/2蛋白的高表达。

　　随着BCRABL酪氨酸激酶抑制剂格列卫成功应用于CML患者，分子靶向治疗越来越成为研究热点。因为在AML患者，不管伴或不伴Nras基因突变，都有AKT、ERK1/2、PAKT和PERK1/2蛋白的高表达，因此有理由相信阻断这两条通路是治疗AML很好的靶点，目前已经有一些针对这两条通路的靶向抑制剂正处于临床试验中，如PD098059、PD184352、U0126、磷脂酰肌醇类似物、perifosine和deguelin等，并且取得了一定的疗效[912]。

　　另外，由于Ras信号通路调控的复杂性，阻断一条通路，机体往往可以通过另一条通路代偿，因此有些靶向药物单独使用有时疗效较差，多个靶向药物的联合应用，阻断多条发病信号通路成为一种必然选择。进一步了解信号传导通路，寻找更多的靶向位点将对AML治疗具有重要意义。

　　【参考文献】

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