高白细胞性急性髓系白血病细胞基因表达谱的研究

　　作者：林筱洁,高瑞兰,陈小红,钱煦岱　　作者单位：1.浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所 杭州 310006 2.复旦大学遗传工程国家重点实验室，生命科学院遗传所

　　【摘要】[目的]综合分析高白细胞性急性髓系白血病不同预后患者祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性以及差异表达的基因。[方法]半固体集落形成法观察不同预后患者骨髓祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性。采用Affymetrix公司人类寡核苷酸表达谱芯片检测患者初诊时骨髓单个核细胞基因表达谱，筛选出差异表达数据。[结果](1)患者骨髓祖细胞集落形成和化疗药物的敏感性与预后密切相关，未缓解者的骨髓祖细胞集落明显高于完全缓解患者，且对化疗药物不敏感。(2)完全缓解患者白血病细胞表达上调2倍以上的基因109条，占0.5%。下调2倍以上的基因134条，占0.6%，其中与预后密切相关的为TRIM16、TM4SF1。CD34和DNMT3B。(3)差异表达的基因按功能分成离子通道运输、细胞周期、细胞骨架运动、细胞凋亡等14类。上调的主要为DNA合成修复、细胞凋亡、细胞周期和应激相关等4类;而下调的主要为蛋白翻译合成、信号传导传递、发育相关和细胞骨架运动等4类。[结论]特定的基因表达模式决定患者预后。

　　【关键词】 高白细胞性急性髓系白血病,基因表达谱,寡核苷酸基因芯片

　　Abstract：[Objective]In order to explore pathogenesis and prognosis of gene expression in hyperleukocytic AML，we analyze the proliferation potency，chemotherapeutic drug susceptibility of leukemic progenitor cells and gene expression profiles by oligonucleotide microarray.[Method]The proliferation potency and chemotherapeutic drug susceptibility of leukemic progenitor cells were detected by colony formation unite assay of bone marrow from untreated hyperleukocytic AML patients with diverse prognosis.The gene expression profiles of leukemia blasts were analyzed from peripheral blood of these untreated patients with the oligonucleotide microarray from Affymetrix Gene Expression Service Lab.The diversity of gene expression was screened and analyzed from hybridization of cDNA chip.[Results](1)The colony formation of 105 cells from bone marrow was 89，95 respectively from two CR cases，and 191，187 separately from two NR patients.The suppression rates of chemotherapeutic drug were higher than 30% in CR cases except that 3 cases to Adr，and lower than 30% in NR patients except that 2 cases to VP16，suggesting that leukemic progenitor cells of NR patients had higher proliferation potency and lower susceptibility to cytotoxic drug.(2)The gene expression level in two CR cases was identified as 109 pieces of up regulation gene and 134 pieces of down regulation gene compared with two NR cases.TRIM16 and TM4SF1，CD34 and DNMT3B among above diversity genes were closely interrelated with prognosis as acute leukemiaspecific genes.(3)Being compared CR with NR of hyperleukocytic AML，both upregulated and downregulated genes by more than two fold could be classified as fourteen sorts according to their function，which had ion channel transport，cell cycle，cytoskeleton action，apoptosis，stress reaction，DNA synthesis/repair，transcription regulation，receptor，immune regulation，intracellular signal pathway，protein translation/synthesis，metabolism，development and other unclassified functions.(4)The four kinds of genes related with DNA synthesis/repair，apoptosis，cell cycle and stress reaction were differential expression of up regulation，while the other four kinds of protein translation/synthesis，intracellular signal pathway，development genes and cytoskeleton action were differential expression of down regulation in CR patients.[Conclusion]The designated gene expression profiles determine the prognosis of hyperleukocytic AML.This significant gene expression profiles may provide useful evidence for the pathogenesis and prognosis in high dangerous hyperleukocytic AML.

　　Key words：hyperleukocytic acute myeloid leukemia;gene expression profiling;Oligonucleotide microarray

　　急性白血病外周血象中白细胞计数超过100×109/L时称为高白细胞性白血病，约占急性白血病的5%～20%[1]。15%～20%的急性髓系细胞白血病患者为高白细胞性白血病，称为高白细胞性急性髓系白血病(高白细胞性AML，hyperleukocytic acute myeloid leukemia)。高白细胞性AML属急性白血病中的高危类型，病情凶险预后极差。目前白细胞单采术联合化疗是一种安全、有效的抢救治疗措施，但完全缓解(CR)病例仍是非常稀少。因此至今仍缺乏准确地早期判断其预后的指标。

　　急性髓系白血病是由多种相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致。基因芯片具有高通量特性，为研究高白细胞性AML预后相关基因提供了有力的工具。本研究应用寡核苷酸基因芯片技术检测不同预后的高白细胞性AML患者初诊时骨髓单个核细胞基因表达谱，旨在筛选早期判断预后基因，为高白细胞性AML的发病机理、早期诊断和治疗提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 病例

　　选择病例为高白细胞性AML，分为未缓解组(NR组，病例1和2)和完全缓解组(CR组，病例3和4)，均为2002年1月至2004年10月以来的本院血液科住院患者，外周血白细胞数分别为162.8×109/L、124×109/L和115×109/L、100.2×109/L。全部于开始治疗前留取骨髓标本，白血病细胞占有核细胞比例为60.2%～97.0%。此时，所有病例均无感染及肝脾淋巴结肿大，各病例的详细资料见表1。患者的诊断和疗效及复发的判断标准参照文献进行[2]。表1 4例患者的临床资料(略)

　　1.2 白血病祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感试验

　　根据本研究所常规液相—半固体相二步琼脂培养法方法[3]，化疗药物分别为三尖杉酯碱(H)1.0mg/L、阿糖胞苷(AraC)55mg/L、阿霉素(Adr)5.5mg/L、足叶乙甙(E，Vp16)25mg/L，37℃饱和湿度、5%CO2条件培养7天后观察结果。以>40个细胞为一个白血病细胞集落。计算抑制率=(对照组集落数实验组集落数)/对照组集落数×100%，以≥30%为对该药敏感，以<30%为不敏感。

　　1.3 高白细胞性AML细胞基因表达谱研究

　　(1)总RNA的提取和纯化：用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)提取患者外周血白血病细胞总RNA，用含甲醛的变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，条带正常清晰的RNA经稀释后测OD值，D260/D280比值应接近2.0。采用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司)纯化总RNA，用含甲醛的变性琼脂糖凝胶电泳检测质量。(2)cDNA的合成和纯化：分别采用onecycle cDNA 合成试剂盒和GeneChip Sample Cleanup Module cDNA试剂盒(Affymetrix公司)。(3)cRNA的合成和纯化、浓度校正和片段化：IVT合成cRNA采用GeneChip IVT Labeling 试剂盒(Affymetrix公司)。纯化方法同总RNA纯化。先根据公式校正cRNA浓度，再进行片段化。采用变性胶电泳质检片段化cRNA。(5)芯片杂交：采用Human Genome U133A array芯片，先进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片。先预杂交芯片，再配制杂交液，每300 μl杂交液含片段化cRNA 0.05μg/μl，Oligo B2 对照50pM，1×真核杂交对照，鱼精DNA 0.1mg/ml，乙酰化BSA 0.5mg/ml，1×杂交Buffer和 DMSO 30 μl。最后杂交芯片，45℃ 60rpm，杂交16h。(6)洗脱和扫描芯片：在洗脱工作站上按照芯片类型，运行洗脱程序。在扫描仪上常规扫描芯片。(7)芯片数据处理方法：芯片扫描所得数据应用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”进行数据处理。信号定量以信号灰度定量为数值，软件分析扫描结果，即信号的强度和比值。扣除本底，消除背景信号对实验信号的干扰，方法是以每个矩阵中的最小信号值作为本底。结果分析：获得样本之间信号值2倍以上的差异表达基因及其分类，并用散点图体现样本之间的基因表达差异。

　　2 结果

　　2.1 高白细胞性AML祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感试验见表2 各病例均可见白血病祖细胞集落(CFUAML)形成，但NR组(病例1和2)患者CFUAML异常增高，分别为191个和187个/105细胞，明显高于CR组(病例3和4)的95个和87个/105细胞。结果提示高白细胞性AML患者祖细胞集落数与预后相关，预后差的病例CFUAML异常增高。表2 各病例的白血病祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感试验(略)

　　结果也提示各病例对化疗药物的敏感性与预后相关。CR组患者药物敏感性好，病例3对H、AraC和Adr三种药物敏感，因此临床应用HA化疗方案2个疗程既获CR。病例4对H、AraC和E三种药敏感，故在临床接连应用HA、HAE、 HAM化疗方案还是能达到CR。而NR组患者以不敏感为主，仅病例2对E敏感。

　　2.2.1 Human Genome U133A array芯片 包含人类基因组中的22，215个已知或未知基因和EST片段。人高白细胞性AML CR患者表达上调2倍以上的基因109条，占0.5%(109/22215)，下调2倍以上的基因134条，占0.6%(134/22215)。

　　2.2.2 人高白细胞性AML CR患者细胞表达上/下调2倍以上的各类基因及个数见表3。表3 人高白细胞性AML细胞差异表达的基因个数及分类(略)

　　2.2.3 人高白细胞性AML CR患者表达上调的109个基因分类见表4。表4 人高白细胞性AML CR患者表达上调的109个基因分类(略)

　　(1)明确与高白细胞性AML预后相关的基因有TRIM16和TM4SF1，分别上调3.1和6.3倍。(2)DNA合成修复重组相关上调2条;细胞凋亡基因上调3条，下调1条;细胞周期基因上调8条，下调3条;应激相关基因上调3条，说明CR患者上述4方面基因上调为主。

　　2.4 人高白细胞性AML CR患者表达下调的134个基因分类见表5。

　　(1)明确与人高白细胞性AML预后相关的基因有CD34和DNMT3B，分别下调3.6和2.5倍。(2)蛋白翻译合成相关基因下调3条;信号传导传递基因上调16条，下调27条。发育相关基因上调4条，下调13条。细胞骨架运动相关基因上调4条，下调16条。说明CR患者上述4方面的基因表达下调为主。表5 人高白细胞性AML CR患者表达下调的134个基因分类(略)

　　3 讨论

　　高白细胞性AML属高危白血病，易发生白细胞淤滞综合征和急性肿瘤细胞溶解综合征等并发症。相当部分病人就根本未曾达到CR或者CCR时间短暂而成为难治性白血病而治疗无效死亡。因此，寻找早期判断预后的敏感指标具有重要意义。

　　骨髓祖细胞集落形成和化疗药物的敏感性试验是检测高白细胞性AML恶性增殖程度和对化疗药物的敏感性，NR患者表现为CFUAML异常增高和对化疗药物的不敏感。敏感药物的应用能使患者达到缓解而预后良好。

　　基因表达谱芯片是目前应用最广泛的基因芯片，寡核苷酸表达谱芯片才是未来发展趋势。本研究采用目前世界上最先进的Affymetrix公司寡核苷酸芯片分析了不同预后的高白细胞性AML患者基因表达谱的改变。差异表达基因上调的主要为DNA合成修复、细胞凋亡、细胞周期和应激相关等4类;而下调的主要为蛋白翻译合成、信号传导传递、发育相关和细胞骨架运动等4类。本研究证明与高白细胞性AML预后相关的基因有TRIM16、TM4SF1、CD34和DNMT3B。

　　TM4SF1[ transmembrane 4 superfamily member 1，四跨膜超家族成员1，又名肿瘤相关抗原L6 (TAAL6)和染色体膜成分3表面标记1(M3S1)]基因定位于染色体 3q213q25，于1992年由Marken J.S 克隆。以往研究表明TM4SF1 在肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达[45]，2006 ASH会议专家认为与AML预后有关。本研究证明TM4SF1基因与高白细胞性AML预后相关，预后好的CR患者表达上调6.3倍。

　　TRIM16[Tripartite Motifcontaining 16，含三联基元16，又名雌激素敏感的B盒蛋白(EBBP)]是转录因子。最近研究表明 TRIM16/EBBP 在细胞因子IL1β的分泌和维甲酸β反应元件(βRARE)的转激活过程中起重要作用[6]。2006 ASH会议专家认为与AML预后有关。本研究证明TRIM16基因与高白细胞性AML预后相关，预后好的CR患者表达上调3.1倍。

　　免疫相关基因尤其是甲基转移酶3B(DNMT3B)基因的下调对预后非常有意义，DNMT活性增高是急性白血病的高发现象，DNMT活性可作为判断急性白血病病情发展和预后的指标之一[7]，DNMT3B基因下调的患者更易获得缓解，高白细胞性AML CR患者DNMT3B基因下调2.5倍。

　　CD34抗原是原始细胞的表型，CD34+是一个预后不良的标志[8]，本研究证明高白细胞性AML CR患者CD34抗原基因表达下调3.6倍，与文献报道一致。

　　虽然本研究采用的两组高白细胞性AML患者的性别和标本中白血病细胞比例不能完全一致，但Affymetrix公司生产的基因芯片具有极高的特异性和灵敏度，重复性好，假阳性率非常低，具完备的芯片设计和强大的生物信息学分析能力，可以获得稳定可靠的结果。基因芯片技术和临床的结合为研究白血病的发生机理、病理分型和推测预后情况等各方面作出重大贡献。

　　【参考文献】

　　[1]曾宾，魏菊荣.高白细胞急性白血病50例分析[J].临床内科杂志，2000，17：241242.

　　[2]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].第2版，北京：科学出版社，1998：171173，214215.

　　[3]高瑞兰，金锦梅，牛泱平，等.人参总皂甙增加白血病细胞对化疗药物的敏感性.中国中西医结合杂志，1999，19(1)：1719.

　　[4]Takahiro T，Hitoshi H，Noboru H.Clinical Significance of CD151 Gene Expression in NonSmall Cell Lung Cancer[J].Clin Cancer Res，2001，7(12)：41094114.

　　[5]DeNardo SJ，Warhoe KA，O’Grady LF，et al.Radioimmunotherapy for breast cancer：treatment of a patient with I131 L6 chimeric monoclonal antibody[J].Int J Biol Markers，1991，6(4)：221230.

　　[6]Munding C，Keller M，Niklaus G，et al.The estrogenresponsive B box protein：a novel enhancer of interleukin1 beta secretion[J].Cell Death Differ，2006，13(11)：19381949.

　　[7]赵玲娣，韩照平.急性白血病患者DNA甲基转移酶活性测定及其意义[J].中国全科医学，2006，(24)：20332034.

　　[8]孟莉.高白细胞性急性白血病CD34抗原表达及临床意义[J].河南医学研究，2000，9(3)：270271.