急性白血病骨髓基质细胞Connexin 43的表达及细胞间通讯功能研究

　　作者：刘耀,张曦,司英健,高蕾,高力,陈幸华　　作者单位：第三军医大学新桥医院血液科，重庆 400037

　　【摘要】本研究探讨急性白血病和正常骨髓基质细胞中连接蛋白43(connexin 43, Cx43)的表达及细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)功能的变化及二者细胞通讯功能之间的差异。体外培养正常及急性白血病骨髓基质细胞，采用细胞免疫组织化学方法及计算机灰度检测观察二者之间Cx43表达的变化，采用细胞划痕染料传输技术比较两者之间GJIC功能的差异。结果显示，体外培养的急性白血病骨髓基质细胞Cx43的表达较正常骨髓基质细胞Cx43的表达明显减低，GJIC功能减弱。结论：急性白血病骨髓基质细胞间通讯功能较正常骨髓基质细胞明显减低。

　　【关键词】 急性白血病

　　Abstract This study was purposed to investigate the connexin 43(Cx43)expression level in acute leukemia bone marrow stromal cells (ABMSCs) and normal bone marrow stromal cells (NBMSCs), and to explore the difference in communicating functions between these cells. The Cx43 expression levels of ABMSCs and NBMSCs were detected by using immunohistochemistry and computer gray scale assay， and the difference of gap junction intercellular communication(GJIC)was examined through dry transfer technique. The results showed that expression level of Cx43 in ABMSCs was lower than that in NBMSCs and its function of GJIC in ABMSCs was also weaker than that in NBMSCs. It is concluded that cellcell communication function is lowered in ABMSCs.

　　Key words Cx43; GJIC; acute leukemia; bone marrow stromal cell

　　J Exp Hematol 2007; 15(4):679-682

　　造血基质细胞所形成的造血微环境(hematopoietic microenvironment，HME)是造血干/祖细胞定殖、分化、发育和成熟的场所[1]。它对造血细胞的自我更新、增殖和分化过程起着重要的调节作用。间隙连接是细胞膜上的连接通道结构，由间隙连接蛋白(connexin，Cx)亚单位构成,它所介导的细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC) 在细胞间传递信号和能量，调控细胞的生长、增殖、分化和形态发生等内环境的稳定。细胞间隙连接通讯功能缺陷与肿瘤的增殖失控和恶性表型的发生有关。人骨髓基质细胞专一表达Cx43[2]，其对造血微环境间隙连接通讯功能的调节尚未见报道，对其在造血系统恶性疾病中的表达差异尚未完全明了。我们采用Cx43抗体免疫荧光染色和划痕标记染料传递方法研究Cx43在正常及急性白血病患者骨髓基质细胞中表达及差异，并对GJIC功能的改变进行讨论。

　　材料和方法

　　标本来源

　　10例骨髓穿刺抽吸标本均取自我院血液科患者，其中急性白血病骨髓标本5例(ALL 2例，ANLLM3 2例，ANLLM5 1例);非血液系统恶性疾病骨髓标本5例(ITP 2例,正常标本 2例，IDA 1例)。

　　主要仪器设备

　　二氧化碳培养箱(SHELD2M2300型,美国产品)、倒置显微镜(Olympus 相差显微镜,日本产品) 、骨髓图文报告分析系统(购自重庆市天海医疗设备有限公司)、超净工作台、台式低温离心机等。中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)急性白血病骨髓基质细胞Connexin43蛋白的表达及细胞间通讯功能研究

　　主要试剂

　　DMEM/F12 培养粉( Gibco 公司产品) ，Ficoll(1.077 g/ ml ,上海试剂二厂产品) ，新生小牛血清( Hyclone 公司产品, -20℃冻存) ，马血清(第三军医大学临床检验教研室提供， -20℃冻存)，LY(Sigma 公司产品)，PBS(第三军医大学临床检验教研室提供)，鼠抗Cx43mAb(Zymed 公司产品)，正常山羊血清(中山生物技术公司产品)，SP免疫组织化学染色试剂盒(购自中山生物技术公司)，DAB染色试剂盒(购自武汉博士德公司)，FITC标记羊抗鼠IgG(Sigma 公司产品)。

　　实验分组

　　实验分为正常骨髓基质细胞组(normal bone marrow stromal cells，NBMSC) 和急性白血病骨髓基质细胞组(acute leukemia bone marrow stromal cells，ABMSC)。

　　基质细胞分离和培养[3]

　　采集骨髓1 ml，用0.9 %生理盐水等倍稀释，缓慢加入预先加有2 ml 淋巴细胞分离液的试管内，400×g离心15 分钟，吸取界面层细胞，生理盐水2 ml 洗涤、450×g离心5 分钟，接种于25 ml 培养瓶内，加入DMEM/F12 2-3 ml (含10 %小牛血清，10 %马血清，青霉素100 U/ml ，链霉素100 mg/ L) ，在37℃、5% CO2 孵箱中培养，24小时后半量换液，以后每周全量换液。对数生长期细胞传代培养，同时将无菌盖玻片置入培养皿中，当细胞贴壁生长至80%-90%时取出玻片。

　　Cx43免疫组织化学染色

　　将单层细胞爬片经PBS洗涤，用40 mg/L多聚甲醛固定20分钟，一抗为兔抗鼠Cx43相关抗原单克隆抗体，二抗采用生物素化羊抗兔IgG。实验步骤按试剂盒说明书进行，采用免疫组织化学SABC法染色，DAB显色。实验中用0.01 mg/L的PBS取代一抗孵育，作为阴性对照。结果判断：Cx43蛋白阳性表达见细胞质和细胞膜棕黄色染色颗粒或斑片。 判断标准：随机选择10个高倍视野，计数1 000个细胞，计数阳性细胞百分率。

　　LY划痕标记荧光传输法

　　将单层细胞爬片用PBS洗涤3次，加入2 ml的 0.5 g/L的LY染料，用手术刀片在玻片上轻轻划线数条，然后将平皿置入37℃接触染料10分钟,吸出染料,再用PBS洗3次，以490 nm波长激发后在荧光显微镜上观察细胞间隙连接通讯状态，细胞间隙连接通讯功能以能通过间隙连接的小分子荧光染料LY从标记细胞向邻近细胞传输的细胞数表示。

　　图像分析

　　免疫组织化学测定结果在显微镜下经图像分析系统进行密度扫描，每组3个样本，每个样本选择30个细胞，测定每组的平均光密度值，再进行比较。正常骨髓基质细胞组和急性白血病骨髓基质细胞组在相同的条件下进行，具有可比性。图像分析软件为Media Cyberneties USA公司的IMAGE PROPLUS软件。

　　统计学分析

　　结果以均值±标准差(±SD) 表示，以SPSS 软件分析，t 检验确定差异显著性，p<0.05 表示差异显著，p>0.05 表示无显著差异。

　　结 果

　　Cx43在正常及急性白血病骨髓基质细胞上的表达

　　体外培养的人正常骨髓基质细胞及急性白血病骨髓基质细胞中均可见Cx43表达，表达部位在细胞膜和细胞浆(图1,2)，但二者表达的强弱不同，阳性率及计算机测量的灰度值经t检验，两组之间有显著差异(p<0.05)(附表)。

　　LY染色传输实验结果

　　LY划痕标记荧光传输实验显示， 人正常骨髓基质细胞，其LY荧光染色弥散5-6个细胞(图3)。急性白血病骨髓基质细胞的细胞间通讯功能显著减弱，LY荧光通过细胞间隙连接传输至较近的细胞(图4)。Figure 1. Expression of Cx43 in NBMSC.Figure 2. Expression of Cx43 in ABMSC.Figure 3. Transmission of LY in NBMSC.Figure 4. Transmission of LY in ABMSC.

　　经统计学处理两组之间有显著差异(P< 0.05)(附表)。同时，染料在正常骨髓基质细胞之间仅需1-2分钟即可通过，而在白血病骨髓基质细胞之间的通过时间延长至10分钟以上。

　　讨 论

　　造血微环境是孕育和调控造血干/祖细胞生长发育的“土壤”，骨髓基质细胞是其主要成分。骨髓基质参与造血调控的重要手段主要通过基质细胞间、基质细胞与造血细胞间频繁的信号转导得以实现[1]。白血病细胞的生长同样依赖异常造血微环境的调控，骨髓基质细胞对白血病细胞所产生的支持和庇护作用是白血病发生和难治的重要因素[4]。GJIC是相邻细胞间普遍存在的直接通讯方式，传递生长抑制和(或)增殖信号,具有传导快、低阻抗等优势。自胚胎发育起，就存在有功能的间隙连接，通过传递小分子递质(如CAMP、ATP、Ca2+等)直接调控组织细胞生长、分化、凋亡[5]。GJIC的物质基础是相邻细胞膜上连接子偶联形成的通讯通道，每个连接子含6个连接蛋白(Cx)。Cx 是一个较保守的蛋白家族，在造血组织中主要为Cx43[6]。

　　近期研究表明，GJIC功能减低或缺失是肿瘤发生过程中的重要事件。在细胞恶变进程中，由于GJIC功能的降低或缺失，来自正常细胞的调控信号不能到达恶变细胞，恶变细胞无限制地生长导致了肿瘤的发生。目前，大多数实体瘤细胞均可检测到Cx的异常，主要表现为Cx基因表达下调，肿瘤细胞与正常组织细胞间的信号传导阻断。Cx43表达的高低与肿瘤细胞的增殖能力呈负相关，转染Cx43基因可上调肿瘤细胞Cx43 mRNA的表达，促进Cx43磷酸化，恢复或增强GJIC功能可有效逆转恶性表型，抑制肿瘤细胞增殖[7]。与实体组织不同的是，骨髓造血实质细胞之间没有或极少存在间隙连接，大量功能活跃的间隙连接存在于骨髓基质细胞及和造血干/祖细胞之间[8]。骨髓造血的这一特点也提示我们应当重视白血病造血微环境中GJIC改变对白血病发生，发展及转归上的作用。

　　为了研究急性白血病骨髓基质细胞与正常骨髓基质细胞在GJIC功能上的差异，本实验选择了正常的及急性白血病的骨髓标本进行体外Dexter培养，通过细胞免疫组织化学检测比较正常及白血病骨髓基质细胞Cx43的表达发现，白血病骨髓基质细胞Cx43表达的阳性率(44±2.4%)明显低于正常骨髓基质细胞(95±4.8%)，两组之间通过计算机测量的灰度值也存在显著差异。

　　采用罗氏黄划痕标记荧光传输技术是测定细胞间隙连接功能的常规方法[9]。细胞间可通过间隙连接交换直径小于1.5 nm，分子量小于1-2 kD的物质，如营养物质、代谢产物、第二信使等，具有传导快，低阻抗的优势。利用小分子荧光染料(罗氏黄的分子量为443 kD)向邻近细胞的传输，可以观察细胞间隙连接通讯的状态。本实验通过染料传输技术发现，在体外培养的白血病骨髓基质细胞间染料传输的细胞级数(1.91±0.44)较正常骨髓基质细胞(5.90±0.72)明显减少，二者存在显著差异，而染料通过时间则延长。以上实验结果表明，急性白血病骨髓基质细胞之间Cx43的表达及由其介导的GJIC水平普遍下降，从而导致了造血微环境支持和调控造血能力的异常，进而促进了恶性表型的进展。可以推论，因为信号通道的减少和缺失，GJIC功能降低所导致的骨髓基质正常造血调控能力下降极有可能影响了白血病细胞的增殖、分化、凋亡过程，是白血病发生过程中的重要因素。

　　恢复细胞的间隙连接通讯也有利于基因和药物治疗。改善细胞间通讯使细胞自身信号在细胞间正常传导，调控细胞按正常的基因程序增殖、分化，这可能是治疗造血系统恶性疾病的一个新的研究方向。

　　【参考文献】

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　　2Krenacs T, Rosendaal M. Connexin43 gap junctions in normal, regenerating, and cultured mouse bone marrow and in human leukemias. Am J Pathol， 1998; 152: 993-1004

　　3 郭朝华，罗成基，孔佩艳等. 放烧复合伤小鼠骨髓基质细胞对粒巨噬系祖细胞生长的影响. 中国实验血液学杂志,1997,7:65-68

　　4张曦，王苹，陈幸华等. 白血病骨髓基质增强HL60细胞抵抗IDA化疗药物研究.中国实验血液学杂志, 2004; 12：163-165

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　　7Kandouz M, Bier A, Carystinos GD, et al. Connexin43 pseudogene is expressed in tumor cells and inhibits growth. Oncogene, 2004; 23: 4763-4770

　　8Cancelas JA, Koevoet WL, dekoning AE, et al. Connexin43 gap junctions are involved in multiconnexinexpressing stromal support of hemopoietic progenitors and stem cells. Blood, 2000; 96:498-505

　　9McKarns SC, Doolittle DJ. Limitations of the scrapeloading/dye transfer technique to quantify inhibition of gap junctional intercellular communication. Cell Biol Toxical, 1992; 7:89-103