特发性血小板减少性紫癜患儿外周血T细胞亚型的分析

　　作者：肖红,刘仿,伍昌林,杨小猛　　作者单位：广东医学院附属医院儿科，湛江 524001; 1广东医学院微生物免疫学教研室，湛江 524023;

　　【摘要】T细胞亚型分化漂移可能与一些自身免疫病的发病机制有关。本研究旨在通过分析特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)患儿外周血Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞的平衡状态，探讨T细胞亚群失衡在ITP发病机制中的作用。收集30例ITP患儿外周抗凝静脉血，分离纯化得T细胞，以PE标记的抗CRTH2单克隆抗体和Cy5标记的抗CD4、CD8单克隆抗体作双色流式细胞术检测，分析ITP患儿Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2比例的变化。结果显示：ITP患儿外周血T细胞与健康儿童相比，Th细胞百分率及Th/Tc比例明显下降(P﹤0.05)，Tc细胞百分率无明显变化(P﹥0.05);Th1及Th2细胞百分率明显下降(P﹤0.05)，Tc1及Tc2细胞百分率无明显变化(P﹥0.05)，Th1/Th2 及Tc1/Tc2比例明显升高(P﹤0.05)。结论： ITP患儿外周血可能存在细胞免疫功能低下及T细胞亚群漂移，Th1及Tc1细胞比例升高，呈明显Th1类细胞优势，此结果说明T细亚群分化异常在ITP发病过程中起着重要作用。

　　【关键词】 特发性血小板减少性紫癜,T细胞亚群,Th/Tc; Th1/Th2 ;Tc1/Tc2;CRTH2

　　Abstract The pathogenesis of some autoimmune diseases has been considered to be related to abnormal differentiation of T cell subsets. This study was aimed at investigating the change of Th1-like and Th2-like cells balance in ITP children，and analyzing the role of T cell subsets disequilibrium in the pathogenesis of ITP. Peripheral blood T cells were collected from 30 ITP patients，the T-cells were isolated and purified. The ratios of Th/Tc，Th1/Th2 and Tc1/Tc2 in peripheral blood T cells were analyzed by immunofluorescence staining and bicolor flow cytometry (FCM) in vitro. The results showed that as compared with the ratios of Th1/Th2 (48.76%±6.17%) and Tc1/Tc2 (18.90%±4.12%) in healthy children，the ratios of Th1/Th2 (56.21%±5.95%) and Tc1/Tc2 (23.09%±3.31%) in ITP children increased obviously. FCM analysis revealed that average percentages of Th，Th1，Th2，Tc，Tc1 and Tc2 were 22.31%±6.51%，21.92%±6.42%，0.39%±0.14%，31.12%±6.15%，30.95%±5.45% and 1.34%±0.84% in ITP children versus 39.24%±5.82%，39.01%±5.47%，0.80%±0.16%，30.25%±5.63%，28.72%±5.20% and 152%±0.68% in healthy children. The average percentages of Th，Th1 and Th2 decreased obviously，while the average percentages of Tc，Tc1 and Tc2 did not changed. It is concluded that the ratios of Th1/Th2 and Tc1/Tc2 in peri-pheral blood T cells increase obviously in ITP children and the cellular immunity in ITP children shiftes to Th1 type immunity superiority，which suggest that the abnormal differentiation of T cell subsets may play an important role in the pathologic process of ITP.

　　Key words idiopathic Thrombocytopenic Purpura; T cell subset; Th/Tc; Th1/Th2 ;Tc1/Tc2;CRTH2

　　特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是一种发病机制尚未完全明了的自身免疫性疾病。目前发现，ITP的发生、发展与患者体内Th1类/Th2类细胞的平衡失调有关[1、2]。目前认为，CRTH2 (chemoattractant receptor-homologs molecule expressed on Th2 cells)是Th2、Tc2特异性表面标志物[3]，本研究应用PE标记的抗CRTH2单克隆抗体和Cy5标记的CD4、CD8作双色流式细胞术检测ITP患儿及健康儿童外周血的T细胞各亚群的百分率。分别以CD4+CRTH2-T、CD4+CRTH2+T、CD8+CRTH2-T及CD8+CRTH2+T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞，分别以CD4+T、CD8+T细胞代表Th、Tc细胞，并进一步探讨Th1类/Th2类细胞在ITP发病机制中的作用。

　　材料和方法

　　研究对象

　　30例ITP患儿均为广东医学院附属医院的患者，男14例，女16例，年龄3个月-12岁，中位年龄3.4岁，诊断均符合ITP诊断标准[4]，并于用药前取外周抗凝血。正常对照30例，为健康儿童，排除ITP及其它自身免疫病，其中男13例，女17例，年龄1-10岁，中位年龄5.3岁。

　　主要试剂和仪器

　　Cy5标记抗CD4、CD8单克隆抗体为EB公司产品，PE标记的抗CRTH2单克隆抗体为Miltenyibiotec公司产品，流式细胞仪为Beckman公司产品(型号为EPICS-XL)，T细胞分离富聚柱(h CD3+ T Cell Enrichment Column)为Becton Dickinson公司产品，淋巴细胞分离液(密度为1.077)为Axis-Shield公司产品。

　　外周血T细胞的分离

　　无菌采集患儿及正常健康儿童外周静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。放于无菌玻璃培养皿内在37℃下培养30分钟，去除黏附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。加入0.85% NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱采用负筛选法获得获纯化的T细胞。用20%的小牛血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。S-AP/P免疫组织化学法检测其纯度大于98%，台盼蓝拒染法检测其活性大于95%。

　　T细胞亚群的测定

　　取3支试管，各加入100 μl T细胞悬液，3管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1-PE和小鼠抗人单克隆IgG1-Cy5(阴性对照管)、抗CD4-Cy5和抗CRTH2-PE(CD4+管)、抗CD8-Cy5和抗CRTH2-PE(CD8+管)，各种标记抗体均15 μl。混匀，4℃避光30分钟，PBS洗涤2次，各管加入0.5 ml缓冲液，上流式细胞仪检测。

　　统计分析

　　所有结果以X±SD表示，两两比较采用成组t检验，经SAS 8.22软件分析(α=0.05)。

　　结 果

　　Th、Tc、Th/Tc的检测

　　ITP患儿外周血Th细胞百分率及Th/Tc比例明显下降，与正常儿童比较差别有统计学意义(P﹤005);Tc细胞百分率无明显变化，与正常儿童比较差别无统计学意义(P﹥0.05)(表1、图1)。Table 1. Determination of T subsets: Th and Tc(略)

　　Th1/Th2、Tc1/Tc2的检测

　　ITP患儿外周血Th1，Th2细胞百分率明显下降，与正常儿童比较差别有统计学意义(P﹤0.05);Tc1，Tc2细胞百分率无明显变化，与正常儿童比较差别无统计学意义(P﹥0.05);Th1/Th2及 Tc1/Tc2比例升高，与正常儿童比较差别有统计学意义(P﹤0.05)(表2、图2)。Table 2. Determination of T subsets: Th1/Th2 and Tc1/Tc2 (略)

　　讨 论

　　自身免疫性疾病是临床上常见的一类疾病，然而自身免疫性疾病的发病机制十分复杂，目前尚未完全明了。研究资料表明，Th/Tc细胞的平衡在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起重要作用[5]。CD4是T辅助/诱导细胞(Th/Ti)的表面标志，CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能，起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8是T抑制/杀伤细胞(Ts/Tc)的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应，它能抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。Th细胞是机体免疫应答的中心细胞，CD4+/CD8+T(Th/Tc)比例变化反应机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。本研究发现，ITP患儿CD4+T(Th)百分率及CD4+/CD8+(Th/Tc)比例均明显降低，CD8+T(Tc)百分率无明显变化。这一结果提示，ITP患儿体内存在细胞免疫调节异常，ITP患儿可能存在T细胞免疫功能低下。但很多学者研究认为，ITP患者体内活性T细胞增多，细胞免疫增强，引起了血小板的损伤[6，7]，这与我们的研究结果并不矛盾，后者是由于活性T细胞凋亡不足，对ITP患者血小板具有损伤作用的活性T细胞比例增加的结果[8]，但ITP患者总体免疫功能可能下降。

　　人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。Mosmann等[9]将Th1/Tc1、Th2/Tc2细胞分别称为Th1类、Th2类细胞。Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生、发展密切相关。Alves等[10]认为，Th1/Th2细胞间的平衡是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽，因此深入探讨Th1类/Th2类细胞平衡对研究包括ITP在内多种自身免疫病有重要意义，然而，长期以来，一直缺乏一种特异性表面标志以区别Th1类/Th2类细胞。近年来有研究发现，CRTH2是检测人Th2和Tc2最为可靠的表面标志。Cosmi等[3]研究认为，尽管不是所有的CRTH2+T细胞产生Th2型的细胞因子，然而CRTH2+T细胞仅包括Th2或Tc2细胞，而不包括Th0或Tc0细胞，亦不包括Th1或Tc1细胞。Tsuda等[11]的实验也表明，CRTH2表达于Th2和Tc2细胞表面，而不表达于Th1和Tc1细胞表面。Nagata等[12]报道，健康人外周血单个核细胞中CD4+T细胞CRTH2的表达率为0.4%-6.5%，本研究以PE标记的抗CRTH2单克隆抗体测得的正常儿童外周血T细胞中CD4+CRTH2+T(Th2)细胞的表达率为(0.80±0.16)%，与Nagata等的结果相似。CRTH2是一种新的G蛋白偶联受体，与C5a受体和FMLP(甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸)受体高度同源，IL-4能够上调其表达，而IFN-γ则下调其表达。CRTH2同时也是前列腺素D2的一种受体，参与白细胞的迁移，可能与炎症反应有关，其具体功能目前尚不清楚。

　　ITP是一种儿童常见的自身免疫性疾病，临床以血小板减少，皮肤、黏膜出血为特征。主要是由于抗血小板自身抗体导致血小板破坏增加所致。然而越来越多的资料显示，除体液免疫机制外，在ITP尤其是慢性ITP的发病过程中，细胞免疫起着非常重要的作用。本研究应用流式细胞术检测纯化的外周血T细胞，分别以CD4+T细胞，CD8+T细胞代表Th、Tc细胞，以CRTH2区分Th1类和Th2类细胞。我们发现，ITP患儿外周血Th1类/Th2类细胞间失衡，呈现明显Th1类优势，这一结果与Anderson等报道一致[13]。同时，我们发现，尽管ITP患儿Th细胞下降，Tc细胞无明显变化，然而Th1/Th2及Tc1/Tc2比例均明显升高，提示在ITP的发病过程中，Th1类/Th2类比例较Th和Tc细胞数所起的作用更为明显。ITP患儿体内Th1类/Th2类比例升高，细胞免疫应答增强，提示机体自身反应性细胞免疫功能亢进。在ITP发生发展过程中，Th1细胞可通过分泌IL-2，IFN-γ等细胞因子，激活细胞毒T细胞、巨噬细胞，吞噬杀伤血小板;而活化的Tc1细胞，也就是通常所说的Tc细胞，则能通过分泌穿孔蛋白、颗粒酶特异性地杀伤血小板。

　　我们的研究表明，对Th1类/Th2类细胞平衡在自身免疫病中作用的研究，不仅有助于阐明自身免疫性疾病的发病机制，而且有可能为我们提供治疗自身免疫性疾病的新方法，即通过调节Th1类/Th2类细胞的动态平衡，来调节过强的自身反应性体液免疫或细胞免疫，达到治疗自身免疫性疾病的目的。

　　【参考文献】

　　1 Mouzaki A，Theodoropoulou M，Gianakopoulos I，et al. Expression patterns of Th1 and Th2 cytokine genes in childhood idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) at presentation and their modulation by intravenous immunoglobulin G (IVIg) treatment: their role in prognosis . Blood，2002; 100: 1774-1779

　　2 周平，吕枫林，姚咏明等. 特发性血小板减少性紫癜患儿T细胞免疫功能的变化. 中华儿科杂志. 1999;37:12-14

　　3 Cosmi L，Annunziato F，Galli MIG，et al . CRTH2 is the most reliable marker for the detection of circulating human type 2 Th and type 2 T cytotoxic cells in health and disease. Eur J Immunol，2000; 30: 2972-2979

　　4 张之南，主编.《血液病诊断及疗效标准》.第2版. 北京: 北京科学出版社. 1998:279-281

　　5 Haggqvist B，Hultman P. Effects of deviating the Th2-response in murine mercury-induced autoimmunity towards a Th1-response . Clin Exp Immunol，2003; 134: 202-209

　　6 Yoshimura C，Nomura S，Nagaham M，et al. Plasma-soluble Fas (Apo-1，CD95) and soluble Fas ligand in immune thrombocytopenic purpura . Eur J Haematol，2000;64: 219-224

　　7 Olsson B，Andersson PO，Jernas M，et al. T-cell-mediated cytotoxicity toward platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura. Nat Med，2003;9:1123-1124

　　8 刘仿，肖红，孟琼等. 特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞凋亡及凋亡蛋白表达的研究. 中国免疫学杂志，2004; 20:202-205

　　9 Mosmann TR，Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1，Th2 and more. Immunol Today，1996; 17: 138-146

　　10 Alves CR，Benevolo-De-Andrade TC，Alves JL，et al. Th1 and Th2 immunological profile induced by cysteine proteinase in murine leishmaniasis . Parasite Immunol，2004; 26: 127-135

　　11 Tsuda H，Michimata T，Sakai M，et al. A novel surface molecule of Th2-and Tc2-type cells，CRTH2 expression on human peripheral and decidual CD4+ and CD8+ T cells during the early stage of pregnancy. Clin Exp Immunol，2001; 123: 105-111

　　12 Nagata K，Tanaka K，Ogawa K，et al. Selective expression of a novel surface molecule by human Th2 cells in vivo. J Immunol，1999; 162: 1278-1286

　　13 Andersson J. Cytokines in idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Acta Paediatr Suppl，1998; 424:61-64.