钠氢交换蛋白-1特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪对HL-60/ADM细胞pHi变化及细胞增殖、凋亡的影响

　　作者：常城,孔佩艳,陈幸华,彭贤贵,刘林　　作者单位：第三军医大学新桥医院血液科，重庆 400037

　　【摘要】为了探讨钠氢交换蛋白-1(NHE-1)抑制剂二甲基氨氯吡咪(DMA)对HL-60/ADM细胞pHi变化及细胞增殖、凋亡的影响，以敏感HL-60细胞为对照，用不同浓度的DMA干预后，荧光指示剂(BCECF/AM)检测法检测细胞内pHi，微量噻唑蓝法(MTT)检测细胞生长的抑制率，流式细胞术检测细胞周期变化，TUNEL法检测原位细胞凋亡，对比HL-60/ADM细胞与HL-60细胞之间的差异。结果显示： HL-60/ADM细胞内pHi较HL-60细胞显著升高;DMA作用下，HL-60/ADM细胞的pHi降低幅度、生长抑制率、细胞凋亡率均显著高于HL-60细胞;当DMA浓度100-150 μmol/L时，HL-60/ADM细胞的G0/G1期细胞比率增加幅度、S期及G2/M期细胞比率降低幅度均高于HL-60细胞。 结论： NHE-1特异性抑制剂DMA引起HL-60/ADM的pHi降低，可抑制细胞生长并诱导细胞凋亡;且DMA对HL-60/ADM细胞的生长抑制作用显著高于HL-60细胞。

　　【关键词】 钠,氢交换蛋白-1

　　Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of dimethyl amiloride (DMA)，a specific inhibitor of Na+/H+ exchanger-1 (NHE-1)，on intracellular pH value(pHi)，proliferation and apoptosis of HL-60/ADM cells in vitro. After treatment with DMA at different doses，pHi of HL-60 and HL-60/ADM cell lines were determined by using pH-sensitive fluorescence dye BECEF-AM; the rate of growth inhibition of cells was detected with MTT assay; cell cycle was detected by flow cytometric DNA analysis; cell apoptosis was observed with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The results showed that pHi in HL-60/ADM cells was higher than that in HL-60 cells. After treatment with DMA at different doses，pHi decreased，the rate of growth inhibition and the rate of apoptotic cells in HL-60/ADM cells were all higher than those in HL-60 cells. Meanwhile，after treatment with DMA during 100 μmol/L to 150 μmol/L，the increase amplitude of G0/G1 phase cells and the decrease amplitude of S+G2/M cells in HL-60/ADM cells were higher than those in HL-60 cells. It is concluded that by causing intracellular acidification，the NHE-1-specific inhibitor DMA inhibits proliferation of HL-60/ADM cells and induces apoptosis of HL-60/ADM cells，and the degree of this growth inhibition of HL-60/ADM cells is higher than that of HL-60 cells.

　　Key words NHE-1; dimethyl amiloride; HL-60/ADM cell; pHi; cell proliferation; apoptosis

　　钠/氢交换蛋白-1(Na+/H+exchanger-1，NHE-1)广泛存在于真核细胞膜上，介导细胞内外1∶1钠/氢交换以维持细胞内的pH值(intracellular pH value，pHi)。NHE-1表达增高和(或)活化可引起细胞内碱化，促进细胞增殖，相反则可导致细胞内酸化，促进细胞凋亡[1，2]。凋亡抑制是白血病多药耐药(MDR)产生的重要机制之一[3]，本研究以HL-60细胞株为对照，检测NHE-1特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪(dimethyl amiloride，DMA)作用下，阿霉素诱导产生多药耐药的HL-60细胞株(HL-60/ADM)pHi改变及其细胞增殖、凋亡变化，探讨DMA对HL-60/ADM细胞生长的影响。

　　材料和方法

　　材料

　　细胞株

　　HL-60细胞株由第三军医大学复合伤研究所提供。阿霉素诱导的耐药HL-60细胞株(HL-60/ADM)购自天津中国医学科学院血液学研究所，实验前经检测证实，该细胞株对临床常用多种化疗药物耐药，细胞表面表达多药耐药相关蛋白(MRP)，细胞内拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)增高。

　　试剂及仪器

　　BCECF-AM购自美国Eugene公司，RPMI 1640培养液、标准胎牛血清为美国Hyclone公司产品，尼日利亚菌素(nigericin)、DMA、噻唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。其他常规试剂为国内试剂公司产品，分析纯。美国PE公司LS-50B荧光分光光度计，国产酶联免疫分析仪。氯化钠缓冲液(PSS，pH 7.4，37℃)、氯化钾缓冲液(37℃下用1N盐酸和1N氢氧化钾分别调定pH为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6)参照文献[4]自行配制。MTT溶于PBS液，工作液浓度为5 mg/ml。

　　细胞培养

　　用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(用1N盐酸调节pH值至7.2)，于饱和湿度，5% CO2、37℃培养箱中培养。HL-60/ADM细胞株常规培养加入阿霉素0.5 μg/ml，实验前无药培养1周。

　　pHi检测

　　荧光强度比值(FIR)测定 按BCECF-AM法[4]进行。取对数生长期的细胞，以1×106细胞重悬于1 ml PBS液中;加入不同浓度DMA，37℃孵育30分钟;加入BCECF-AM(终浓度1 μg/ml)，37℃孵育30分钟;PSS漂洗后置于LS-50B分光光度计上用双波长比例测量法检测，激发波长为495 nm和440 nm，发射波长为530 nm。FIR=495 nm/440 nm。

　　pHi标准曲线制作 参照文献[4]进行。细胞分别重悬于上述不同pH值氯化钾缓冲液中，加入BCECF-AM、Nigericin(终浓度5 μmol/L)孵育30分钟，以pH值和对应FIR求出回归方程，作出pHi标准曲线。根据此曲线将检测FIR转换为相应的pHi值。

　　细胞生长抑制率的MTT法检测

　　取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔板，0.2 ml/well。同时分别加入不同浓度DMA，每种浓度设4个复孔，设置不加DMA的阴性对照孔和不加细胞的空白对照孔。常规培养48小时后加入MTT工作液20 μl/well，孵育5小时，离心后弃上清，加入DMSO 0.15 ml/well，震荡10分钟使结晶充分溶解，酶标仪570 nm波长检测OD值，根据OD值计算相应抑制率。

　　抑制率=1-(OD检测-OD空白)/(OD阴性-OD空白)

　　细胞周期检测

　　对数生长期细胞加入不同浓度DMA共同培养24小时，细胞悬液用70%的冷乙醇固定后，调整细胞浓度为106/ml;PI染色(50 μg/ml)，4℃避光孵育30分钟，在流式细胞仪(美国FACS)上进行检测。

　　原位细胞凋亡率检测

　　对数生长期细胞分别与不同浓度DMA共同培养12、24、48小时，离心涂片机涂片;采用TUNEL法，封片后光镜高倍镜(×400)下观察，至少观察5个视野，计数200个细胞以上，计算阳性细胞百分率。

　　统计分析

　　细胞周期检测数据采用总体率假设检验。其余数据以均数±标准差(x±SD)表示，用Microsoft Excel 2000软件进行t检验。

　　结 果

　　pHi变化

　　HL-60/ADM细胞pHi值较HL-60细胞显著增高(P<0.01)。用不同浓度的DMA干预后，HL-60/ADM细胞内pHi降低幅度高于HL-60细胞(表1)。Table 1. pHi value of HL-60 and HL-60/ADM cells after treatment with different concentration of DMA(略)

　　DMA对细胞生长的抑制率

　　在不同浓度DMA作用下，HL-60/ADM细胞生长的抑制率均高于HL-60细胞，且DMA对细胞生长抑制率随剂量增加而增高，HL-60/ADM对剂量增加更为敏感(表2)。Table 2. Growth inhibition rates of HL-60 and HL-60/ADM cells after treatment with different concentration of DMA

　　(略)

　　不同细胞周期的细胞比率变化

　　当DMA浓度为100-150 μmol/L时，HL-60细胞及HL-60/ADM细胞的G0/G1期细胞比率均显著高于未加药时，S期及G2/M期细胞比率均显著低于未加药时，且HL-60/ADM细胞的G0/G1期细胞比率

　　增加幅度、S期及G2/M期细胞比率降低幅度高于HL-60细胞(表3)。Table 3. Cell ratio changes of HL-60 and HL-60/ADM cells in various phases of cell cycle after treatment with different concentrations of DMA (略)

　　细胞凋亡检测

　　在DMA作用下各组凋亡率均较对照组显著增高(P<0.01)，凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而增高(表4)。Table 4. Cell apoptosis rate of HL-60 and HL-60/ADM cells after treatment with different concentrations of DMA (略)

　　讨 论

　　MDR是导致白血病及其他各种恶性肿瘤化疗失败的最主要原因。目前已知存在多种MDR机制，且在同一种耐药细胞内可能存在多种耐药机制，这使得逆转MDR更加困难。Larsen等[5]发现，细胞内碱化是肿瘤细胞MDR产生后的共同变化，且与何种耐药机制无关。我们测得HL-60细胞株的pHi为7.387±0.054，与文献报道一致[6]，耐药的HL-60/ADM细胞株pHi为7.478±0.044，较HL-60细胞株显著增高，证实MDR细胞有比敏感细胞更高的pHi。目前已知，肿瘤细胞pHi的升高可改变化疗药物的分布，减少碱性化疗药物与靶位的结合。许多化疗药物结合到细胞内靶点是pH依赖性的，轻微的细胞内pH梯度的改变即可对药物蓄积、胞噬和分泌产生影响。在化疗药物负荷下，肿瘤细胞内可以出现包含药物的酸性囊泡，通过胞吐作用将化疗药物排出胞体外。敏感细胞内酸性囊泡数量比耐药细胞少，提示敏感细胞活性分泌通道移除药物分子的能力较低[6，7]。这提示pHi的增高可影响细胞对化疗药物的敏感性，可能是白血病细胞产生MDR的必要条件之一。

　　本研究发现，在相同浓度DMA作用下，HL-60/ADM细胞的生长抑制率、细胞凋亡率均显著高于HL-60细胞，G0/G1期细胞比率显著高于HL-60细胞，S期及G2/M期细胞比率显著低于HL-60细胞，这些结果说明在一定范围内HL-60/ADM细胞对DMA更为敏感。有研究表明，拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱)是通过改变pHi来诱导和/或促进细胞凋亡的，耐药HL-60细胞能够抵抗这种细胞内酸化现象的产生，因而获得耐药性;多药耐药HL-60细胞内，Bcl-2的表达和磷酸化明显多于敏感细胞，并且不受凋亡诱导剂调控，这与耐药细胞pHi相对较高的现象一致[8，9]。

　　NHE-1是细胞内pH值最主要的调节者，其表达及活性直接影响细胞内pH值的水平。有报道显示，NHE-1表达及活性增强导致细胞凋亡抑制[10]。陈杰[11]等运用抑制消减杂交技术筛选耐药及敏感肺癌细胞差异表达基因，发现耐药细胞表达增强的片段之一与NHE-1有高度的同源性，提示NHE-1在多药耐药中可能存在重要作用。NHE-1如何导致肿瘤细胞产生MDR尚需要进一步研究，NHE-1介导的pHi升高很可能是MDR产生的重要机制之一，抓住这个共同途径“研究MDR产生机制，可能为寻找逆转MDR的方法提供新的思路。既然DMA作为NHE-1特异性抑制剂，可通过改变NHE-1活性来降低细胞内pH值，那么运用DMA作用于耐药白血病细胞能否增加细胞内化疗药物的有效分布、降低耐药细胞凋亡阈值，以达到逆转MDR的作用，这是值得进一步探讨的。

　　【参考文献】

　　1Quinn DA，Du HK，Thompson BT，et al. Amiloride analogs inhibit chronic hypoxic pulmonary hypertension . Am J Respir Crit Care Med，1998; 157(4 Pt 1):1263-1268

　　2吴国明，钱桂生，黄桂君等. 钠-氢交换蛋白1反义表达载体对人肺腺癌细胞钠-氢交换蛋白1基因表达的影响及其意义. 中华结核和呼吸杂志，2004; 27: 191-194

　　3Malinowska I，Stelmaszczyk-Emmel A，Wasik M，et al. Apoptosis and pH of blasts in acute childhood leukemia. Med Sci Monit，2002; 8: CR441-447

　　4Zhu WH，Loh TT. Effects of Na+/H+ antiport and intracellular pH in the regulation of HL-60 cell apoptosis. Biochim Biophys Acta，1995; 1269: 122-128

　　5Larsen AK，Escargueil AE，Skladanowski A. Resistance mechanisms associated with altered intracellular distribution of anticancer agents. Pharmacol Ther，2000; 85: 217-229

　　6Wang E，Lee MD，Dunn KW. Lysosomal accumulation of drugs in drug-sensitive MES-SA but not multidrug-resistant MES-SA/Dx5 uterine sarcoma cells. J Cell Physiol，2000; 184: 263-274

　　7Weisburg JH，Curcio M，Caron PC，et al. The multidrug resistance phenotype confers immunological resistance. J Exp Med，1996; 183: 2699-2704

　　8Goossens JF，Henichart JP，Dassonneille L，et al. Relation between intracellular acidification and camptothecin-induced apoptosis in leukemia cells. Eur J Pharm Sci，2000; 10: 125-313

　　9Palissot V，Belhoussine R，Carpentier Y，et al. Resistance to apoptosis induced by topoisomerase I inhibitors in multidrug-resistant HL-60 leukemic cells. Biochem Biophys Res Commun，1998; 245: 918-922

　　10Vereninov AA，Vassilieva IO，Yurinskaya VE，et al. Differential transcription of ion transporters，NHE1，ATP1B1，NKCC1 in human peripheral blood lymphocytes activated to proliferation. Cell Physiol Biochem，2001; 11: 19-26

　　11陈杰，钱桂生，黄桂君等. 肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定. 癌症，2001; 20: 348-353