脐血与外周血NKT细胞的体外扩增及其表型比较

　　作者：刘嬿,范华骅,阮鸣,高跞,聂晓绚,杨懿铭　　作者单位：上海市血液中心血液工程研究室，上海 200051

　　【摘要】为了建立体外有效扩增脐血与外周血天然杀伤T细胞(NKT细胞)的方法并研究其表型的差异，分别采用单加IL-2及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法，从人脐血单个核细胞(UCB-MNC)和人外周血单个核细胞(PB-MNC)中扩增NKT细胞;用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+ TCR Vβ11+)的比例及其它表型特征。结果显示： UCB-MNC在第7天时，其TCR Vαβ+ NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±419)%，是原来的(8.74±4.37)×102倍 ( P<0.01)，而且大多不表达NK1.1(CD161);TCR Vβ11+较TCR Vα24+高表达;第14天时，PB-MNC中的TCR Vαβ+NKT细胞扩增量占淋巴细胞的(11.1±3.61)%，是原来的(372±201)×102倍(P<0.01)，且NK1.1高表达，TCR Vβ11+与 TCR Vα24+表达率基本一致。结论： α-Galcer对NKT细胞有特异的扩增功能，且脐血NKT的扩增效率较外周血高。以表型划分，脐血中的NKT细胞多为NK1.1-，而外周血多为NK1.1+，是一种新的NKT细胞亚型。

　　【关键词】 脐血

　　Abstract Purpose of this study was to establish an effective method in vitro to proliferate natural killer T (NKT) cells from umbilical cord blood (UCB) and periperal blood (PB)，and to study their different phenotype. Mononuclear cells (MNC) from UCB and PB were cultured in the presence of IL-2 (100 U/ml)，with or without alpha-Galcer. TCR Vα24 Vβ11 double positive natural killer T-cells (NKT cells) and their other phenotypes were determined by flow cytometry. The results showed that after expansion for 7 days，TCRVαβ+ NKT cells from UCB-MNCs increased by (8.74±4.37)×102 times as much，but most of them did not express NK1.1 and its TCR Vβ11+ was higher than TCR Vα24+. After expansion for 14 dyas，TCR Vαβ+ NKT cells from PB-MNCs increased by (3.72±2.01)×102 times，the expression of NK1.1 was high and its TCR Vβ11+ was almost equal to TCR Vα24+. It is concluded that human TCR Vα24 Vβ11 double positive NKT cells can expand by addition of α-Galcer. The proliferation efficiency in UCB-MNCs is greater than that in PB-MNCs. Most of the UCB-NKT is NK1.1-，while the PB-NKT is NK1.1+，a new subset of NKT cells.

　　Key words umbilical cord blood;periperal blood;natural killer T cell;α- Galcer;phenotype

　　新近研究发现，构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系——NKT细胞。这种细胞有严格的CD1d限制性，且具有大量释放IL-4和IFN-γ的能力[1]。NKT细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。但是，NKT细胞在人体内的含量极少，仅占全血细胞的0.02%左右，很难用于临床研究和治疗。本研究通过对脐血与外周血中NKT细胞的扩增，探讨一种高效的体外扩增NKT细胞的方法，并同时比较两种不同来源NKT细胞间的表型差异，现报告如下。

　　材料和方法

　　试剂与仪器

　　Ficoll-Paque细胞分离液(密度1.077 g/ml，Phamarcia公司产品);12孔细胞培养板(Corning公司产品);RPMI 1640培养基(Gibco公司产品);KRN7000

　　( αlpha-galactosylceramide，简称 α-Galcer，日本麒麟公司惠赠，100 ng/ml);IL-2(R&D公司产品);PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体(Immunotech公司产品);6%羟乙基淀粉(HES)生理盐水溶液(B.Braun公司产品);EPICS ELITE ESP型流式细胞仪(Beckman-Coulter公司产品)。

　　方法

　　脐血单个核细胞(UCB-MNC)的制备 新鲜采集的正常人脐血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4∶1加入6% HES液中，吹打均匀后4℃下静置1小时，吸取中间白膜层用0.6% ACD-PBS对倍稀释，混匀后以2∶1的比例加入Ficoll上层，离心(700×g，20分钟)，取中间细胞环，用PBS洗3次，悬浮于含10% FCS的完全培养液中。

　　外周血白膜和单个核细胞(PB-MNC)的制备 采自健康献血着的200 ml全血，离心制备白膜(840×g，14分钟)，用PBS对倍稀释，混匀后以2∶1的比例加入Ficoll上层，离心(700×g，20分钟)，取中间细胞环，用PBS洗3次，悬浮于含10% FCS的完全培养液中。

　　脐血/外周血中NKT细胞的扩增 将新鲜分离的UCB/PB-MNC分别接种于含10% FCS完全培养液的12孔细胞培养板中，每实验孔接种密度为5×105/ml，分设实验组MNC+ IL-2(5 U/ml)和MNC+α-Galcer(100 ng/ml)+ IL-2(5 U/ml)，并以MNC单独培养作为空白对照组。37℃、5 % CO2及饱和湿度的条件下培养。

　　形态观察 应用双相倒置显微镜，每12小时观察细胞形态1次。

　　NKT细胞的含量及表型检测 吸取100 μl培养的细胞，各加入20 μl PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体，避光孵育15分钟，加入0.5 ml PBS，作双荧光检测，测定第7天和第14天TCR Vα24+ Vβ11+ NKT细胞含量及其他表型特征。

　　统计学处理

　　采用SAS 6.0统计软件作配对t检验。

　　结 果

　　脐血/外周血NKT细胞的扩增

　　IL-2刺激单个核细胞中NKT细胞的扩增 扩增后脐血/外周血TCR Vαβ+ NKT细胞分别占各自淋巴细胞的百分率为：第7天时，UCB-NKT为(0.29±009)%，PB-NKT为(0.18±0.07)%;第14天时，UCB-NKT为(0.24±0.28)%，PB-NKT为(0.21±0.10)%。与MNC单独培养组相比，脐血/外周血NKT细胞的扩增效率无显著性差异(P>0.05)(表1)。

　　α-Galcer和IL-2联合刺激单个核细胞中NKT细胞的扩增 加用α-Galcer后，NKT细胞的扩增效率有明显提高，分别占各自淋巴细胞的百分率为：第7天时UCB-NKT为(24.48±4.19)%，PB-NKT为(4.10±1.60)%;第14天时，UCB-NKT为(12.15±2.02)%，PB-NKT为(11.10±3.60)%。尤其是培养到第7天的UCB-NKT和第14天的PB-NKT分别是原来的(8.74±4.37)×102倍和(3.72±2.01)×102倍，与MNC单独培养组和MNC+ IL-2组相比，均有显著性差异(P<0.01)(表1，图1)。

　　形态学观察 α-Galcer+ IL-2组的脐血NKT细胞培养至4-5天出现聚集现象，第7-8天时，有聚集团出现且多漂浮，增殖明显，细胞呈大圆形或椭圆形。2周左右，部分细胞变小、萎缩。随着培养时间的延长，细胞逐渐死亡，而外周血NKT细胞培养至11-12天才出现聚集现象，而且不如脐血NKT细胞出现的聚集现象多(图2-4)。Table 1. Proliferation of TCR Vαβ+ NKT cells (略)

　　脐血/外周血NKT细胞的表型差异

　　选取TCR Vαβ+NKT细胞较多的7dUCB-NKT和14dPB-NKT作比较，发现脐血NKT细胞同时表达TCR Vα24和TCR Vβ11，而且后者的表达率远高于前者，在TCR Vβ11+的细胞中，CD161低表达。外周血NKT细胞也同时表达TCR Vα24和TCR Vβ11，且两着的阳性率基本一致，在TCR Vβ11+的细胞中，CD161高表达(表2，图5-9)。Table 2. Different phenotypes between UCB and PB(略)

　　讨 论

　　NKT细胞是一种新型的T细胞亚群，有着很高的临床应用价值。研究发现，非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的T 细胞介导性自身免疫糖尿病的发生与NKT细胞的缺失密切相关[2]。而且，输注NKT细胞能抑制I型糖尿病的发生。同时，在其他一些自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、硬皮病中，NKT细胞的数量均较正常人明显减少[3，4]。因此，作为细胞免疫治疗的一种途径，在体外建立一种能大量扩增NKT细胞的方法，分析它的表型特征，对于今后临床研究及诊断治疗都具有一定的意义。

　　本研究采用两种不同的标本来源——脐血和外周血，利用NKT细胞可受非经典MHC-I 样分子CD1d的限制性呈递，特异性识别一些糖脂类抗原，如α-Galcer，在体外大量扩增。由于CD1d不仅表达在DC上，在NKT细胞的某一亚型或在单个核细胞及B细胞上也有表达[5]，所以即使在抗原呈递细胞(如DC)不参与的情况下，脐血和外周血的NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)仍有良好的扩增效率。实验表明，单用IL-2刺激的实验组中，无论是脐血还是外周血NKT细胞的扩增效率与对照组相比，均无明显的改变(P>0.05);而加用α-Galcer后，NKT细胞的扩增效率有明显提高(P<0.01)。研究证实了IL-2虽为T细胞的增殖活化因子，但不具特异性，对NKT细胞的扩增效果不明显;而α-Galcer确实有刺激NKT细胞扩增的作用，与文献报道一致。脐血中的NKT细胞虽未成熟，但其本身因为已具备了与α-Galcer结合的互补配体，所以同样也表现出良好的扩增效果。

　　另外，本研究分别在第7天和第14天时记录了两种不同来源NKT细胞TCR Vα24+TCR Vβ11+的表达率。结果发现，扩增前UCB-MNC中的NKT细胞少于外周血，但经过7天的细胞扩增，以UCB-MNC为来源的NKT 细胞扩增效率明显好于外周血(P<0.05)。随着时间的推移，以PB-MNC为来源的NKT 细胞的TCR Vα24+TCR Vβ11+表达率呈逐渐上升的趋势，到培养的第14天时，PB-NKT细胞的扩增量也达到了(11.10±3.60)%，是原来的(3.72±2.01)×102倍(P<0.01)。实验结果显示，虽然一开始脐血中的NKT细胞不如外周血中那么多，但经有效刺激后，无论在细胞扩增时间还是细胞因子的使用量方面，脐血均较外周血有明显优势。

　　现已证明，NKT细胞有一经典的表型特征，那就是它恒定表达TCR Vα24和TCRβ11，但本实验又对其作了其他表型的流式细胞术测定。结果发现，以外周血为来源的NKT 细胞除了经典表达TCR Vαβ之外，其TCR Vα24+的表达率与TCR Vβ11+基本一致，且另外还高表达NKRP-1(CD161)，即为NK1.1+的经典型NKT 细胞;但目前新的研究发现，NKT 细胞本身又有多种亚型之分[6]，其中一种是为NK1.1-的非经典型NKT 细胞，这类细胞除了特异性表达TCR Vαβ外，其表面CD161低表达。而且在功能方面，这群细胞在治疗由MCA诱发的恶性肉瘤方面有独特的缓解作用[7]。本实验从脐血中获得的NKT细胞，其表型就呈现出这种特征，它特异性表达TCR Vα24和TCR Vβ11，而且在所有TCR Vβ11阳性细胞中，大多不表达CD161。我们推测，不同来源的NKT细胞，其CD161可能有着截然不同的表现，以本实验培养的NKT细胞为例，外周血中多含NK1.1+，以脐血单个核细胞为来源的多为NK1.1-，但此两类细胞是否还存有哪些其他表型的差异，还有待我们进一步研究。另外与外周血相比，脐血NKT细胞的TCR Vβ11+的表达率远远高于TCR Vα24+，推测NKT细胞的表型表达可能与其本身的发育成熟度有关，脐血中的NKT细胞因尚处于细胞生成早期阶段，大多尚未成熟，TCR Vβ11是其先行表达的表型之一。

　　随着对NKT细胞的不断深入研究，体外有效扩增NKT细胞的方法建立为今后进一步临床研究奠定了一定的基础。但如何将NKT细胞由幼稚转变为成熟以及细胞表型与功能之间究竟存在着何种联系，还有待我们进一步探讨。

　　【参考文献】

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　　2Hammond KJ，Poulton LD，Palmisano LJ，et al. alpha/beta-T cell receptor (TCR)+CD4-CD8- (NKT) thymocytes prevent insulin-dependent diabetes mellitus in nonobese diabetic (NOD)/Lt mice by the influence of interleukin (IL)-4 and/or IL-10. J Exp Med，1998;187:1047-1056

　　3Sumida T，Sakamoto A，Murata H，et al. Selective reduction of T cells bearing invariant V alpha 24J alpha Q antigen receptor in patients with systemic sclerosis. J Exp Med，1995;182:1163-1168

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　　5Ueda Y，Hagihara M，Gansuvd B，et al. The effects of alpha GalCer-induced TCRValpha 24 Vbeta 11(+) natural killer T cells on NK cell cytotoxicity in umbilical cord blood. Cancer Immunol Immunother，2003;52:625-631

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　　7Karnbach C，Daws MR，Niemi EC，et al. Immune rejection of a large sarcoma following cyclophosphamide and IL-12 treatment requires both NK and NKT cells and is associated with the induction of a novol NKT cell population. J Immunol，2001;167:2569-2576