竹节参总皂苷对人白血病细胞株HL60的作用

【摘要】  目的：研究竹节参总皂苷（total saponins of Panax japonicus, TSPJ）对人白血病细胞HL60的作用，探讨其作用机制，为进一步开发竹节参提供理论依据。方法：体外培养人早幼粒白血病细胞HL60，细胞计数法观察TSPJ对细胞活力的影响，四唑氮蓝（nitroblue tetrazolium, NBT）测定其对细胞还原能力的影响，流式细胞仪检测细胞周期变化和膜表面分化抗原CD11b的表达情况。结果：和阴性对照组比较，不同浓度TSPJ处理的细胞活力显著下降，NBT阳性细胞增多，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，膜表面分化抗原CD11b的表达量增多。结论：TSPJ对体外培养的HL60细胞生长有一定抑制作用，其作用机制与诱导细胞分化和周期阻滞有关。

【关键词】  竹节参; HL60细胞; 细胞分化

　　Effects of total saponins of Panax japonicus on human leukemic HL60 cells

　　Ding YUAN1, 2, Rui ZUO1, Changcheng ZHANG1, 2

　　1. Medical College, Three Gorges University, Yichang, Hubei Province 443002, China

　　2. Hubei Province Key Laboratory of Natural Products Research and Development, Three Gorges University, Yichang, Hubei Province 443002, China

　　Objective: To study the effects of total saponins of Panax japonicus (TSPJ) on human leukemic HL60 cells.

　　Methods: Human leukemic HL60 cells were cultured in vitro. The cancer cell vigor was detected by using cell counting kit8. Nitroblue tetrazolium (NBT) was used for measuring cell reduction. The cell cycle and the expression of differentiation antigen CD11b were detected by flow cytometry.

　　Results: Compared with the negative control group, TSPJ in different concentrations could decrease the vigor of HL60 cells and the number of cells in S phase and upregulate the CD11b expression, while the numbers of NBT positive cells and cells in G0/G1 phase in the different concentrations of TSPJtreated groups were increased.
Conclusion: TSPJ can inhibit the HL60 cell growth in vitro. Its mechanism may be related to inhibiting proliferation and inducing cell differentiation and cycle arrest.

　　Keywords: Panax japonicus; HL60 cells; cell differentiation

　　Yuan D, Zuo R, Zhang CC. J Chin Integr Med / Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2007; 5(5): 570572. Received April 13, 2007; published online September 15, 2007. Free full text (PDF) is available at www.jcimjournal.com
   
　　竹节参又名白三七，具有活血化瘀、消肿止痛、止血祛痰和滋补强壮之功效。我们的前期研究表明,竹节参提取物具有一定的抗肿瘤作用［1］，为进一步研究竹节参总皂苷（total saponins of Panax japonicus, TSPJ）对白血病细胞的影响，本实验观察了TSPJ对白血病细胞株HL60的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  TSPJ制备  竹节参干燥粉末用甲醇提取，成浸膏后用水饱和正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇至无醇味，然后上D101大孔树脂，水洗除去多糖等杂质，收集65％乙醇洗脱部分，回收乙醇，真空干燥至粉末状，溶于RPMI1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，浓度为200 mg/ml。

1.2  主要药品与试剂  RPMI1640，SIGMA公司产品；胎牛血清，杭州四季青生物技术有限公司产品；细胞计数试剂盒（cell counting kit8, CCK8）为日本同仁化学研究所产品；WrightGiemsa染液、四唑氮蓝（nitroblue tetrazolium, NBT）和四丙基氢氧化铵（tetrapropyl ammonium hydroxide, TPA）均为GIBCO公司产品。

　　1.3  细胞培养  HL60细胞株购自中国典型培养物保藏中心细胞库；细胞置于含10%胎牛血清的1640培养液，在5%CO2、37 ℃的二氧化碳培养箱中培养。

　　1.4  细胞生长抑制率测定  取对数生长期HL60细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种细胞悬液于96孔板内，每孔接种100 μl；将100 μl的药物加入细胞悬液，共分9组：阴性对照组及8种浓度TSPJ处理组，浓度依次为12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/ml，每组设5个复孔。分别培养12、24和48 h后，在每个孔内加入10 μl CCK8试剂，把培养板放在培养箱内继续培养3 h，迅速在多功能酶标仪上以450 nm测量波长和600 nm参比波长测定各孔吸光度值（OD值），并计算各组细胞生长抑制率。

　　1.5  NBT还原能力检测  HL60细胞培养至对数生长期后，将药物加入细胞悬液中，并将2 ml细胞终浓度调成1×105～5×105个/ml，细胞共分3组：阴性对照组、100 μg/ml和200 μg/ml TSPJ处理组。在5％CO2、37℃培养箱内培养72 h后，将各组细胞悬液离心，弃上清，加入0.1% NBT溶液0.5 ml和TPA溶液20 μl，37 ℃孵育1 h后，各组细胞离心，弃上清，取沉淀涂片，迅速风干，WrightGiemsa染色10 min，PBS轻轻冲洗，风干后油镜下随机计数200个细胞，细胞内有蓝黑色颗粒者为NBT阳性细胞，计算阳性细胞百分率。

　　1.6  细胞周期和膜表面分化抗原的测定  HL60细胞培养至对数生长期后，将药物加入细胞悬液中，共分3组：阴性对照组、100 μg/ml和200 μg/ml TSPJ处理组，在5％CO2、37 ℃培养箱中培养18 h后，将各组细胞悬液离心，弃上清，用PBS轻轻洗涤2次，并将细胞调成1×106～5×106个/ml的悬液，于4 ℃下用75%乙醇固定30 min，用含核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）及碘化丙啶（propidium iodide, PI）的染色液染色30 min后，上流式细胞仪检测DNA含量，分析细胞周期变化，并测定膜表面分化抗原CD11b的表达水平。

　　1.7  统计学方法  实验数据用x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析。

　　2  结  果

　　2.1  TSPJ在不同浓度和不同时间对HL60细胞生长的影响  在作用12、24和48 h后，TSPJ对细胞生长的抑制率逐渐升高；TSPJ对细胞生长的抑制率亦随其浓度的增加而升高。见表1。

　　表1  TSPJ对HL60细胞生长的影响　略

　　2.2  不同浓度药物对HL60细胞NBT还原能力的影响  药物作用48 h后，TSPJ处理组NBT阳性细胞分别占37.9%、53.5%，阴性对照组细胞的NBT阳性细胞占6.9%。与阴性对照组比较，不同浓度TSPJ处理组的NBT阳性细胞均明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。说明HL60细胞在TSPJ的作用下，其功能和生化变化正向成熟粒细胞方向改变。见表2。

　　表2  TSPJ对HL60细胞NBT还原能力的影响　略

　　2.3  对细胞周期和膜表面分化抗原的作用  流式细胞仪检测结果表明，药物作用18 h后，100 μg/ml和200 μg/ml TSPJ处理组G0/G1期细胞所占比例都增多，分别占56.9%和71.8%，与阴性对照组39.6%相比，差异有统计学意义（P<0.01）。100 μg/ml和200 μg/ml TSPJ处理组S期细胞所占比例均减少，分别占33.3%和25.0%，与阴性对照组（58.2%）比较，差异有统计学意义（P<0.01）。100 μg/ml TSPJ处理组G2/M期细胞所占比例占9.8%，与阴性对照组（2.2%）比较，差异有统计学意义（P<0.01）；200 μg/ml TSPJ处理组G2/M期细胞所占比例占3.2%，与阴性对照组比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。

TSPJ作用18 h后，HL60膜表面分化抗原CD11b表达量随其剂量的增加而升高，100 μg/ml TSPJ处理组CD11b表达量为2.18%，与阴性对照组（0.56%）相比，差异有统计学意义（P<0.05）；200 μg/ml TSPJ处理组CD11b表达量为34.5%，与阴性对照组相比，差异亦有统计学意义（P<0.01）。结果显示相对于100 μg/ml，200 μg/ml浓度的作用较强。

　　3  讨  论
   
　　竹节参又名白三七、竹节人参，系五加科人参属植物竹节参的干燥根茎，呈竹鞭状，主要分布地区西起云南西部，东至日本和长江以南，且存在狭叶竹节参、竹节参等变种。竹节参在民间使用悠久，具有滋补强壮、止血祛痰、活血化瘀和消肿止痛等功效；现代研究表明其主要活性成分是TSPJ和人参皂苷［2］。根据竹节参民间应用的经验及三萜类皂苷抗肿瘤活性，提示竹节参可能具有较显著的抗肿瘤活性。我们前期研究发现TSPJ对荷瘤小鼠显示出抗肿瘤活性［1］。为进一步研究TSPJ的抗肿瘤作用，我们进行了其对白血病细胞株HL60作用的研究。研究发现TSPJ对HL60细胞的增殖抑制呈量效关系和时效关系。小于0.1 mg/ml的TSPJ对HL60细胞无显著的增殖抑制作用，大于0.8 mg/ml的TSPJ作用2 d后，细胞增殖受抑明显并出现较强杀伤作用。分别经100 μg/ml和200 μg/ml TSPJ处理48 h后的HL60细胞可获得不同程度的NBT还原能力，其中200 μg/ml TSPJ处理后，53.5％的细胞呈现NBT阳性反应，说明竹节参可能有诱导白血病细胞分化的作用；流式细胞仪检测发现200 μg/ml TSPJ处理后的HL60细胞膜表面分化抗原CD11b表达量显著增加，揭示TSPJ在一定低浓度下可诱导HL60细胞向粒细胞分化。同时TSPJ可导致HL60细胞周期阻滞（G0/G1期阻滞），说明其具有抑制DNA复制的作用。本实验结果说明，TSPJ具有一定的抑制HL60增殖和诱导分化的作用，其作用机制还有待进一步研究。

【参考文献】
  　1 Yuan D, Zuo R, Zhang CC. Effects of total saponins of Panax japonicus (TSJP) on tumor growth in mice. Shi Zhen Guo Yi Guo Yao. 2007; 18(2): 277278. Chinese with abstract in English.
袁丁, 左锐, 张长城. 竹节参总皂苷抑制小鼠肿瘤细胞生长的实验研究. 时珍国医国药. 2007; 18(2): 277278.

　　2 Yuan D, Zuo R. Research on chemical constituents and biological activities of rhizoma of Panax japonicus. Shi Zhen Guo Yi Guo Yao. 2005; 16(9): 838839, 841. Chinese with abstract in English.
袁丁, 左锐. 竹节参化学成分和药理活性研究进展. 时珍国医国药. 2005; 16(9): 838839, 841.