慢性粒细胞白血病微卫星不稳定性的检测及其意义

      ［摘要］目的 探讨不同位点微卫星不稳定性（MSI）和杂合性缺失（LOH）与慢性粒细胞白血病（CML）各期的关系。方法 应用多重PCR技术检测CML病人不同时期8、9、17号染色体上5个微卫星位点的MSI和LOH。结果 在D8S555位点，CML加速、急变期（AP+BC）病人的MSI发生率明显高于慢性期（CP）病人，差异有显著意义（ P =0.009）;8号染色体上D8S555、D8S559位点MSI发生率明显高于9、17号染色体上D9S67、TP53A1/A2、AFMa127xg9位点 ，AFMa127xg9位点LOH发生率明显高于其他4个位点，差异有显著性（ χ 2 =1.858～9.946，P < 0.05、0.01）。结论 微卫星遗传不稳定性是CML发生和转化过程中的常见事件;不同位点微卫星不稳定性在CML病情演变中所起作用不同;AFMa127xg9位点附近可能存在与CML发生、发展密切相关的新抑癌基因。

　　［关键词］ 染色体不稳定性;杂合性缺失;微卫星重复;白血病，髓样，慢性

　　DETECTION AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE OF MICROSATELLITE INSTABILITY IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

　　WU CHUN-MEI， LU WEI， WANG ZHONG-YING

　　（Department of Hematology， Qingdao University Medical College， Qing- dao 266021， China）

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of microsatellite instability （MSI） on differ-ent chromosome and chronic myeloid leukemia （CML） at different stages. MethodsUsing multiplex-PCR，the MSI and loss of heterozegosity （LOH） on 5 microsatellite loci of chromosome 8， 9 and 17 in chronic myeloid leukemia were detected. Results The frequency of MSI at D8s555 locus in patients with CML at chronic， accelerated， blastic stages was significant differences （ P =0.009）. CML patients showed higher frequency of MSI on D8S555 and D8S559 loci than that of at D9S67 and AFMa127xg9 loci （ χ2 =5.680， 8.096; P <0.05）， but the frequency of LOH on D9S67 and AFMa127xg9 loci was higher. The positive rate of LOH on AFMa127xg9 locus was 29.7%， which was higher than that of the other four loci （ χ2 =1. 858-9.946; P <0.05，0.01）. ConclusionMicrosatellite instability is common in the initiation and development of CML. MSI or LOH detected at deferent loci shows deferent significance. The high incidence of LOH on AFMa127xg9 suggests that there might be a new tumor suppressor gene around this site relating to the episode of CML.
　　
　　［KEY WORDS］chromosomal instability; loss of heterozygosity; microsatellite repeats; leukemia， myeloid， chronic
　　
　　微卫星（MS）是广泛存在于原核及真核细胞基因组中的简单串联重复的DNA序列，约占人类基因组的10%［1］。由于微卫星DNA具有丰富的多态性、高度的杂合性以及较低的重组率等特点，已被广泛应用于人类基因组计划中的基因制图、遗传病诊断、法医学等各个领域。近年来，人们发现微卫星在恶性肿瘤及相关疾病中可表现出不稳定性（MSI）和杂合性缺失（LOH），因而对微卫星的监测成为寻找和定位抑癌基因、探讨肿瘤发生机制的一个重要方法［2，3］。慢性粒细胞白血病（CML）是一种造血干细胞起源的血液系统恶性肿瘤，其病程发展经历慢性期、加速期和急变期。对于慢性期转变为加速期的机制 尚未研究清楚。本文用多重PCR技术检测CML不同时期的多个微卫星位点的MSI和（或）LOH，以期探索其与CML发生及病情进展的关系。

  　1 对象与方法

　　1.1 对象 CML病人37例，来自青岛大学医学院附属医院，包括慢性期（CP）27例，加速期和急变期（AP+BC）10例;男20例，女17例;年龄12～70岁，中位年龄47.1岁。诊断依据文献［4］标准。选择同期5例健康查体志愿者作为正常对照组。

　　1.2 方法

　　1.2.1标本制备 收集CML病人的骨髓标本，正常对照组外周血，同时刮取口腔黏膜标本做自身对照，参考本室常规方法分别提取骨髓、外周血与口腔黏膜标本DNA备用。

　　1.2.2引物合成 选取与CML病人不同时期染色体改变密切相关的8、9、17号染色体上5个微卫星位点:D8S555、D8S559、D9S67、TP53A1/A2、 AFMa127xg9 ，从基因库中查出其引物序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成所需引物，引物序列见表1。

　　表1 第8、9、17号染色体5个微卫星位点引物序列 （略）

　　1.2.3PCR扩增 将引物分成两组，用多重PCR方法同时扩增病人的骨髓（或正常对照组的外周血）和口腔黏膜DNA。

　　1.2.4产物分析 将扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，用凝胶成像分析仪分析是否存在MSI和（或）LOH。

　　1.3 统计学处理 用卡方检验（包括校正检验和精确检验法）。

　　2 结果

　　2.1 各期CML病人MSI和（或）LOH发生率比较 27例CP病人中14例发生MSI和（或）LOH，10例AP+BC病人中8例发生了MSI和（或）LOH，二者比较，差异无显著性（ P =0.152）。

　　2.2 不同微卫星位点MSI和（或）LOH的发生率及其比较 在D8S555位点，CML CP病人的MSI发生率为7.4%，AP+BC为40.0%，但未见LOH。进展期（AP+BC）病人的MSI发生率明显高于CP病人，差异有显著性（ P =0.009）。同时出现两个和两个以上位点改变者10例，其中CP病人6例，AP+BC病人4例，二者差异无显著性（ P =0.407）。8号染色体的D8S555、D8S559位点MSI的发生率明显高于9、17号染色体的3个位点，差异均有显著意义（ χ2 = 5.680、8.096，P <0.05）。17号染色体的AFMa127xg9 位点 LOH 的发生率为 29.7% ，明显高于其他4个位点，差异有显著性（ χ2 =1.858～ 9.946 ，P <0.05、0.01）。见表2。

　　表2 CML病人各期不同微卫星位点的MSI、LOH发生情况（略）

　　2.3 正常对照组的MSI和（或）LOH发生情况 正常对照组5例外周血细胞与口腔黏膜细胞DNA电泳、银染后得到的条带都完全相同，未见到MSI和（或）LOH。

　　3 讨论

　　慢性白血病是一种克隆性、多能造血干细胞疾病，发病率为1/100 000，发病高峰在50～60岁之间。其临床特征为:髓系增生，白细胞增多伴嗜碱粒细胞增多，脾大。病情发展最终由慢性期进展到加速期，最后到致命的急变期。特征性的染色体异常t（9，22）（q34:q11）导致bcr-abl融合基因的形成，其产物bcr/abl酪氨酸激酶的活性比野生型abl酪氨酸激酶的活性更强，这在CML的发病中起重要作用［5］。一般认为，CML急变时70%的病人可以出现额外的染色体异常，这种变化的出现比血液学和临床表现的恶化要早几个月，可作为估计预后的有价值的指标［6］。分子生物学技术的发展对CML的发病机制及病程演变的研究起了进一步推动的作用。PCR技术检测微卫星的不稳定性在研究CML发生发展机制中被广泛应用。WADA等［7］检测了19例CML进展期和20例慢性期病人的5个不同微卫星位点的MSI，结果显示，进展期有10例病人检测到至少2个微卫星位点的MSI，而20例慢性期病人中没有1例检测出同样位点的MSI，认为由于复制和修复机制缺陷导致微卫星不稳定性这一频繁事件的发生同CML进展关系密切。OHYASHIKI等［8］用荧光技术对73例不同类型白血病的7个微卫星标记进行连续研究发现，在CML慢性期没有微卫星不稳定性，而急变期时微卫星不稳定性出现的频率明显升高，达25%，且出现多个位点不稳定性者占50%以上，因此认为，多个基因位点的不稳定性与CML的急变有关联。李戈等［9］检测17例CML加速期和急变期病人的2个微卫星标记，发现有8例出现MSI或LOH，表明慢性白血病在加速期和急变期检出微卫星不稳定性的频率明显高于慢性期。本文结果显示，进展期病人D8S555位点处的MSI发生率明显高于慢性期病人，与文献报道相符;同时也观察到所选的其他4个位点上，加速期和急变期病人发生一个或多个位点的MSI和（或）LOH的频率与慢性期病人无显著性差异;8号染色体的2个位点D8S555、D8S559的MSI发生率明显高于9、17号染色体的3个位点，而17号染色体的AFMa127xg9位点LOH发生率明显高于其他4个位点，在9q34上的D9S67位点和17号染色体的TP53A1/A2位点上MSI和（或）LOH发生率都较低，且只发生在慢性期，这说明CML的演变是一个遗传学改变高度异质性的过程，微卫星遗传不稳定性广泛存在于疾病全过程，不同微卫星的改变在这一过程中发挥的作用也不同。MORI等［10］对17例处于由慢性期向急变期进展的CML病人的10个微卫星标记进行研究，也没有发现MSI，认为这些微卫星区域改变没有参与CML的进展。另外，MEZA等［11］研究发现，CML出现额外染色体异常如+8、i（17q）的频率具有地区民族差异。所以，我们分析不同文献结果不同的原因除与所选择的微卫星位点不同有关外，可能还与人种、地域等因素造成的微卫星多态性有关。如何科学选择微卫星位点检测慢性白血病不同时期的MSI和LOH的临床意义还有待于更多、更进一步的研究。

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　　［8］ OHYASHIKI J H， OHYASHIKI K， AIZAWA S， et al. Rep-lication errors in hematological neoplasias: genomic instability in progression of disease is different among different types of leukemia ［J］. Clin Cancer Res， 1996，2（9）:1583-1589.

　　［9］ 李 戈，宋玉华，钱林生， 等. 微卫星Mfd41和DCC的遗传不稳定性与CML病程发展关系研究 ［J］.中华血液学杂志，1998，19（8）:405-408.

　　［10］ MORI N， TAKEUCHI S， TASAKA T， et al. Absence of mi-crosatellite instability during the progression of chronic mye-loid leukemia ［J］. Leukemia， 1997， 11（1）:151-152.

　　［11］ MEZA ESPINOZA J P， CARDENAS V， GUTIERREZ-AN-GULO M， et al. Secondary chromosomal changes in 34 Phila-delphia-chromosome-positive chronic myelocytic leukemia pa-tients from the Mexican West ［J］. Cancer Genet Cytogenet， 2004，148（2）:166-169.