白血病病人血栓前状态分子标志物的变化及临床意义

      ［摘要］目的 观察白血病病人凝血、抗凝及纤溶指标的变化，以探讨凝血系统的变化与白血病并发出血的关系。方法 采用酶联免疫吸附法，检测了86例初发白血病病人的血浆D-二聚体（D-D）、血小板α颗粒膜蛋白-140（GMP-140）、血管性血友病因子∶抗原（vWF∶Ag）的含量，发色底物法检测抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）活性，并与45例健康人比较。结果 白血病病人血浆D-D、GMP-140、vWF∶Ag含量明显升高，与对照组比较差异有显著性（ t= 9.208～ 10.782，P <0.001），且急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）病人各指标变化明显高于急性淋巴细胞性白血病（ALL）及慢性白血病病人（ t=5.237～31.598，P <0.001），而ANLL病人AT-Ⅲ活性明显低于ALL、慢性白血病病人及对照组（ t=9.857～19.963，P <0.001），慢性白血病病人除了vWF∶Ag含量高于对照组外（ t=2.534， P < 0.05 ），其余各指标与对照组比较差异无显著性（ t=0.301～1.889，P >0.05）。白血病病人血浆GMP-140、vWF∶Ag、D-D、AT-Ⅲ活性水平之间呈明显的相关性（ r=-0.759～0.915，P <0.05、0.01）。结论 白血病病人存在明显的高凝状态，表现为血小板活性增加及血管内皮细胞损伤，抗凝活性降低及继发纤溶功能亢进。

　　［关键词］ 白血病;血栓前状态;D-二聚体;膜蛋白质类;vWF;抗凝血酶Ⅲ

　　CHANGES OF PRETHROMBOTIC MOLECULAR MARKERS IN PATIENTS WITH LEUKEMIA AND THEIR SIGNIFICANCE

　　JIANG ZHONG-XIN ， CHEN GANG，LIU CHENG-YU

　　（Department of Diagnostics， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the relationship between incidence of hemorrhage in patients with leukemia and changes of the markers of coagulation， anticoagulation and fibrinolysis. MethodsPlasma platelet granular membrane protein 140 （GMP-140）， von Willebrand factor Ag （vWF∶Ag）， D-dimer（D-D） were detected by Enzyme Linked Immunosorbent Assay （ELISA）， Anti-thrombin Ⅲ （AT-Ⅲ） activity by chromogenic substrate method in 86 patients. The results were compared with 45 healthy subjects. ResultsThe levels of plasma membrane proteins， vWF∶Ag， D-D were significantly elevated in the patients and dif-fered significantly from the control （ t=9.208-10.782，P <0.001）. The changes of molecular markers in patients with ANLL were elevated significantly than those with ALL and chronic leukemia （ t=5.237-31.598，P <0.001）. The levels of plasma AT-Ⅲ activity in patients with ANLL were lower significantly than those with ALL， chronic leukemia and control group （ t=9.857- 19.963 ，P <0.001）. There was no significant difference between patients with chronic leukemia and the controls （ t=0.301- 1.889 ，P >0.05） except the levels of vWF∶Ag （ t=2.534，P <0.05）. There were significant correlations between the molecular markers in patients with leukemia （ r=-0.759-0.915; P <0.01，0.05）. ConclusionThere exists an obvious hypercoagulable state in patients with leukemia. The activation of platelet， fibrinolytic system and the injury of vascular endothelium in patients with leukemia may be the causes of bleeding.

      ［KEY WORDS］leukemia; prethrombotic state; membrane proteins; vWF; D-Dimer; antithrombin Ⅲ

　　出血是急性白血病的常见并发症及致死的重要原因［1，2］，主要见于急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病及急性粒细胞白血病，而在慢性白血病病人比较少见，这可能与急性白血病病人血小板减少有关，还可能与急性白血病病人体内凝血、纤溶状态的改变密切相关。为了进一步探讨白血病病人体内血栓前状态分子标志物的变化及其对白血病并发出血的影响，本文检测了86例白血病病人的 D-二聚体（D-D）、血小板α颗粒膜蛋白-140（GMP-140）、血管性血友病因子∶抗原（vWF∶Ag）及抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）活性的变化，现将结果报告如下。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1对照组 临床健康体检者45例，均无心、脑血管疾病，无肝、肾疾病以及出血、血栓性疾病，血压、血脂、血糖及心电图均正常，其中男23例，女22例，年龄（57±4）岁。

　　1.1.2白血病组我院附属医院血液科2000年5月～2004年12月住院病人86例，男46例，女40例，年龄（59±6）岁。其中急性白血病病人52例，均为初发，包括急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）40例，急性淋巴细胞性白血病（ALL）12例，均符合FAB分型的诊断标准。慢性白血病病人34例，包括慢性粒细胞白血病（CML）22例（慢性期14例，急变期8例），均符合1989年贵阳第二届全国白血病治疗讨论会的诊断及分期标准;慢性淋巴细胞白血病（CLL）12例，均符合1981年CLL国际工作会议诊断标准。白血病组及对照组年龄、性别差异无显著性。

　　1.2 标本的采集与保存方法 所有白血病病人于入院明确诊断后于清晨空腹采肘静脉血。标本采集要迅速，取1.8 mL注入含 0.2 mL的 20 g/L EDTA-2Na的塑料管内，1 h内 3 000 r/ min离心10 min，取血浆分装于EP管内，-30 ℃保存，30 d内用于检测血浆GMP-140、 vWF∶ Ag及D-D的含量;同时取1.8 mL注入含 0.2 mL 枸橼酸钠的真空管内，1 h内3 000 r/min离心10 min，用于AT-Ⅲ活性的检测。

　　1.3 检测方法 D-D酶免试剂盒由上海捷门生物技术有限公司提供，GMP-140、vWF∶Ag酶免试剂盒由上海太阳生物公司提供，均采用ELISA双抗体夹心法检测，反应后在酶标仪上492 nm波长下测吸光度，再计算其血浆含量。AT-Ⅲ活性测定采用发色底物法，试剂由Diagnostica Stago公司提供。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件进行分析，检测结果以 x±s 表示。两均数间比较采用 t 检验，变量间相关关系采用Pearson相关性检验。

　　2 结果

　　2.1白血病病人D-D、GMP-140、vWF∶Ag含量及AT-Ⅲ活性的变化 白血病病人血浆D-D、GMP-140、vWF∶Ag含量显著升高，与对照组比较差异均有显著性（ t= 9.208～ 10.782，P <0.001），而AT-Ⅲ活性明显降低（ t=-7.138，P <0.001）。ANLL病人D-D、GMP-140、vWF∶Ag含量明显高于ALL及慢性白血病病人（ t=5.237～31.598，P <0.001）;AT-Ⅲ活性明显低于ALL、慢性白血病病人及对照组（ t= 9.857～ 19.963 ， P < 0.001 ）。 慢性白血病病人除了vWF∶Ag高于对照组外（ t=2.534，P <0.05），其余各指标与对照组比较差异无显著性（ t=0.301～1.889，P >0.05）。见表1。

　　2.2 白血病病人各指标之间的相关关系 白血病病人血浆GMP-140、vWF∶Ag、D-D、 AT-Ⅲ活性水平之间呈明显的相关性（ r= -0.759～ 0.915，P <0.01）。

　　表1 白血病病人各组血浆D-D、GMP-40、vWF∶Ag含量及AT-Ⅲ活性的比较（略）

　　与对照组比较，△t=9.208～10.782，P <0.001;*t=2.534，P <0.05;与ALL及慢性白血病病人比较，#t= 5.237～31.598，P <0.001

　　3 讨论

　　研究表明，白血病病人的止血、凝血功能障碍是普遍存在的病理生理变化。高凝状态是白血病病人并发血栓或出血的重要发病机制之一［1］，但常规的凝血指标很难检测这种高凝状态。近几年的研究表明，通过检测凝血激活的某些微量的分子标志物可反映体内高凝状态或血栓形成等情况［3］。本文通过检测白血病病人凝血、抗凝及纤溶系统激活的分子标志物，试图从凝血、纤溶系统的角度为白血病病人高凝状态的形成机制提供依据。结果显示，白血病病人的血浆GMP-140、vWF∶Ag、D-D水平明显增高，其中ANLL病人各指标升高尤为显著，提示ANLL病人处于明显的血液高凝状态，且血栓前状态分子标志物的水平与白血病的分型有密切关系。D-D作为交联纤维蛋白单体的特异性降解产物，可作为体内高凝状态和继发性纤溶功能亢进的分子标志物之一［4，5］。本文结果显示，急性白血病病人血浆D-D水平显著升高，且ANLL病人血浆D-D水平明显高于其他类型白血病病人，说明白血病病人普遍存在继发性纤溶功能亢进的病理生理改 变，以ANLL病人增高尤其明显，与文献报道相一致［6］。GMP-140是血小板的α-颗粒内容物，是体内血小板活化的分子标志物［6］。本文结果显示，初发白血病病人血浆 GMP-140 水平明显增高，说明初发 白血病病人其血小板活化功能明显增强，而有的研 究表明， 低水平的P-选择素是AML并发出血的预后判断指标［1］，显示初发白血病病人的血小板活化功能是增强的，随着疾病的进展，凝血因子被消耗有可能出现低凝，进而出现出血。vWF作为血管内皮细胞受损的分子标志物，内皮细胞受损时血浆中vWF∶Ag水平升高。vWF的增高有利于血小板的黏附，并可作为桥梁分别与血管胶原纤维及血小板膜上的糖蛋白受体（GPIb）黏附，促进血小板黏附聚集［7，8］。本文结果显示，急性白血病病人的血浆vWF∶Ag水平明显升高，说明内皮损伤在这些病人的凝血系统激活中起重要作用，而慢性白血病病人除了vWF∶Ag与对照组比较差异有显著性之外，其他指标均无显著差异，显示在慢性白血病病人中虽然凝血、纤溶系统没有明显激活，但已经出现了内皮细胞的损伤。vWF还可促进纤维蛋白原的合成，使血液黏滞性增加，有利于血栓的形成，而应用抗血小板药物治疗可使vWF水平降低［9］。AT-Ⅲ为一种生理性抗凝因子。本文结果显示，AT-Ⅲ在ANLL病人中明显降低，在慢性白血病病人中降低并不明显，说明白血病病人的抗凝功能明显降低，从而使血液处于血栓前状态，这与文献报道一致［10］。白血病病人各指标之间的相关性表明机体为了维持凝血、抗凝及纤溶系统的平衡状态，机体加速了纤溶系统的激活，血小板活化、纤溶功能异常、血管内皮损伤及抗凝活性的降低在白血病高凝状态的发病机制中起重要作用，随着凝血因子的消耗有可能出现低凝状态而诱发出血。因此，临床上血栓前状态分子标志物的检测对白血病病人的抗凝及治疗的 监测具有重要的意义。

［参考文献］

　　［1］ LEINOE E B， HOFFMANN M H， KJAERSGAARD E， et al. Prediction of haemorrhage in the early stage of acute mye-loid leukemia by flow cytometric analysis of platelet function［J］. Br J Haematol， 2005，128（4）:526-532.

　　［2］ ULRIKE N G， ELVIRA A， GUDRUN F， et al. Thromboem-bolic events in children with acute lymphoblastic leukemia: prednisone versus dexamethasone administration［J］. Blood， 2003，101（7）:2529-2533.

　　［3］ L PEZ Y， PALOMA M J， RIF N J， et al. Measurement of prethrombotic markers in the assessment of acquired hyperco-agulable states［J］. Throm Res， 1999，93（2）:71-78.

　　［4］ 韩 崇旭，李锦堂，苏天水，等. 心脑血管疾病止血与纤溶相关指标的临床研究［J］.中华血液学杂志，2001，22（3）:147-148.

　　［5］ SHITRIT D， IZBICKI G， SHITRIT A B， et al. Normal D-di-mer levels in patients with latent tuberculosis infection［J］. Blood Coagul Fibrinolysis， 2005，16（1）:85-87.

　　［6］ 张 晓晖，宋善俊，胡豫，等. 砷剂和维甲酸对急性早幼粒细胞白血病凝血异常作用的临床研究［J］.中华内科杂志，2001，40（12）:829-833.

　　［7］ 姜 忠信，刘成玉，谭齐贤. 冠心病病人血栓前状态分子标志物及临床应用［J］.齐鲁医学杂志，2001，16（3）:259-261.
 
　　［8］ JANE C M， CATHERINE P M H， THEODORE E W， et al. Decreased von Willebrand factor protease activity associated with thrombocytopenic disorders［J］. Blood， 2001，98（6）:1842-1846.

　　［9］ 王 学锋，吴方，曾晓颖. 高凝状态病人凝血分子标志物的检测及其临床意义［J］.上海医学检验杂志，2000，15（3）:180-182.

　　［10］ 秦 燕春，张铀. 急性白血病病人抗凝血酶Ⅲ，蛋白C，蛋白S和α2 纤溶酶抑制物活性的改变［J］.陕西医学检验，2000，15（4）:3-4.