液相色谱-串联质谱法快速测定人血浆中利培酮的浓度

【摘要】  目的 建立测定人血浆中利培酮浓度的反相高效液相串联质谱电喷雾检测法。方法 以迪马C18反相柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）为色谱柱，流动相为甲醇5 mmol·L-1甲酸铵（体积比90∶10），流速为1 mL·min-1，柱温：25 ℃，以醋酸乙酯二氯甲烷（体积比4∶1）为提取剂。样品经电喷雾离子源正离子化后，通过三重四级杆串联质谱仪，采用选择反应监测对利培酮（m/z 411→191）和内标拉莫三嗪（m/z 256→145）进行测定。结果 利培酮的高（50 μg·L-1）、中（25 μg·L-1）、低（1 μg·L-1）3个浓度的方法回收率均大于96%，提取回收率均大于85%，日内（n=5）、日间（n=3）RSD均小于10%；最低检测浓度为0.5 μg·L-1；线性范围为：0.5～100 μg·L-1,回归方程为F=55.9562ρ-0.3423，r=0.999（n=8）。结论 该方法灵敏、准确、简单、快速，可用于临床血药浓度监测和药动学研究。

【关键词】  利培酮；血药浓度；拉莫三嗪；反相高效液相串联质谱电喷雾法

基金项目：广州市医药卫生研究基金（2006YB117；2007YB106）；广东省医院药学研究基金（200714）
　　　　Determination of risperidone in plasma by LCESIMS/MS

　　WEN Yuguan,LIAO Rifang，ZENG Zhuznping，ZHANG Ming

　　(Department of Clinical Pharmacology,Guangzhou Brain Hospital,Guangzhou 510370，China；Department of Pharmacy,Second Affiliated Hospital of Sun Yatsen University,Guangzhou 510120,China；Department of Epidemiology,Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou 510240,China)

　　Abstract:Objective To set up a rapid analysis method of risperidone in plasma by liquid chromatographyelectrospray ionizationtandem mass spectrometry (LCESIMS/MS).Methods Risperidone was extracted from plasma with ethyl acetatedichiloromethane (4∶1).The residues were analyzed on a Dikma diamonsil C18 column (4.6 mm×150 mm，5 μm) with the mobile phase consisted of methanol and 5 mmol·L-1 of ammonium formate (90∶10).The flow rate was 1 mL·min-1 and column temperature 25 ℃.An Agilent 6410 triple quad mass spectrometer system equipped with an electrospray ionization iontrap source was used as the detector.The system was operated in the selected reaction monitoring mode transmitting m/z 411→191 transitions for both the analyte and the lamotrigine internal standard.Results The average recovery and extraction recovery for risperidone were more than 99.6% and 85%，respectively.The values for withinday and betweenday precision and accuracy were less than 10%.The calibration curves were linear over a concentration range of 0.5-100 μg·L-1(r = 0.998,n=8）.The limits of detection for risperidone was 0.5 μg·L-1 . Conclusion The method provides a sensitive,accurate,precise and reliable analytical procedure for clinical monitoring of plasma risperidone.

　　Keywords:risperidone；plasma concentration；lamotrigine;LCESIMS/MS

　　利培酮(risperidone)是一种选择性的单胺能拮抗剂，对5HT2受体、D2受体、α1及α2受体和H1受体亲和力高，临床上广泛用于治疗精神分裂症。其检测方法文献报道采用高效液相色谱法［1-3］和LCMS检测法［4-6］。为便于进行血药浓度监测和药动学研究，本文参照文献［6］建立一种以醋酸乙酯和二氯甲烷为混合萃取剂、拉莫三嗪为内标的测定人血浆中利培酮浓度的反相高效液相串联质谱电喷雾检测法（LCESIMS/MS）。

　　1  材料

　　1.1  仪器
    
　　Agilent 1200 HPLC仪，Agilent 6410 Triple Quad LC/MS，Agilent色谱化学工作站（软件版本编号B.01.00）；旋涡混合器（原上海医科大学仪器厂）；SARTORIUS电子天平（瑞士）；MICRO1224高速离心机（美国）；MMMGROUP真空干燥箱（德国）。

　　1.2  药品与试剂
    
　　利培酮对照品(西安杨森制药有限公司，批号：050705，质量分数>99.5%)，内标物为拉莫三嗪（葛兰素史克制药有限公司，批号：051130，质量分数>99.5%）。甲醇（色谱纯，Agilent公司），水为超纯水，甲酸铵（质谱纯，Agilent公司），其余试剂均为分析纯。

　　1.3  对照品溶液
    
　　精密称取利培酮10.0 mg加甲醇溶解并定容至10 mL，于冰箱4 ℃避光保存，临用时用甲醇稀释成所需的浓度。

　　1.4  内标溶液
    
　　精密称取拉莫三嗪适量，用甲醇制成质量浓度为10 mg·L-1的溶液，即得。

　　2  方法和结果

　　2.1  色谱条件
    
　　迪马公司diamonsilTM C18反相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇5 mmol·L-1甲酸铵（体积比90∶10），流速1 mL·min-1，柱温25 ℃。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，干燥气流速10 L·min-1，干燥气温度350 ℃，雾化气压力344.75 Pa，毛细管电压4 000 V，采用选择反应监测（SRM），利培酮检测离子对为m/z 411→191，四级杆停留时间200 ms，裂解电压180 V，裂解能量28单位，信号放大400 EMV；内标物拉莫三嗪检测离子对为m/z 256→145，四级杆停留时间200 ms，裂解电压130 V,裂解能量40单位，信号放大400 EMV。利培酮和拉莫三嗪的保留时间分别为2.227 min和1.789 min。LCMS/MS图谱见图1。

　　2.2  样品处理
    
　　量取0.2 mL含药血浆加至2.0 mL锥形离心管中，加入 500 μg·L-1的拉莫三嗪甲醇溶液50 μL快速振荡5 s，加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液50 μL，振荡5 s。加入1 mL醋酸乙酯二氯甲烷（体积比4∶1），密塞，旋转振荡30 s，16 000 r·min-1离心5 min，吸取有机层转入1.5 mL锥形离心管内，37 ℃真空干燥至干。进样前加入0.2 mL甲醇溶解，快速振荡10 s溶解残渣，吸取2 μL进样。

A.空白血浆；B.空白血浆+拉莫三嗪+利培酮(0.5 μg·L-1)；C.一病人服药后血浆样品；1.789 min—拉莫三嗪；2.227 min—利培酮

　　图1  利培酮LCMS/MS色谱图（略） 

　　Fig.1  LCMS/MS chromatogram of risperidone

　　2.3  标准曲线的制备
    
　　取空白血浆0.2 mL 8份，分别加入质量浓度为0，2，4，10，20，40，100，200，400 μg·L-1的利培酮对照品溶液，振荡5 s，使血浆药物浓度相当于0，0.5，1，2.5，5，10，25，50，100 μg·L-1，然后按“2.2”项方法处理。经LCMS/MS分析，以测得的利培酮峰面积与内标峰面积之比（A）作纵坐标，以血浆利培酮浓度(ρ)为横坐标，得到0.5～100 μg·L-1范围的血浆利培酮浓度标准曲线为：A=55.956 2ρ-0.342 3，r=0.999，权重系数w=1/ρ。当RS/N=11时,最低检测浓度为0.05 μg·L-1。分别取5个不同来源空白血浆0.2 mL，分别加入2 μg·L-1的利培酮甲醇溶液50 μL，按照“2.2”项操作，测得结果为(0.56±0.017) μg·L-1，RSD为3.00%。

　　2.4  回收率及精密度试验
    
　　按“2.3”项方法分别配制高、中、低3种质量浓度（50、25、1 μg·L-1）的利培酮血浆溶液各15份，分为3批，每批5份，并于每批的标准曲线同时进行，依“2.2”项处理后，取2 μL进样，计算质控样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法的准确度和精密度。同法以空白血浆，除不加标准系列溶液和内标外，按“2.3”项方法处理后，再加入相应浓度的利培酮，残留物以0.2 mL流动相溶解，离心后取2 μL进样，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果见表1。

　　2.5  血浆样品的稳定性试验
    
　　按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种质量浓度（50、25、1 μg·L-1）的3组血浆样品,分别在室温（放置6、12、24 h）、长期冻存（-20℃冻存1、2、3周）和冻融（冻融1、2、3次）条件下分别进行色谱测定，结果高、中、低3个浓度的RSD分别为2.05%～3.40%、2.66%～4.78%、1.87%～4.65%。

　　表1  回收率与日内、日间精密度（略）

　　Tab.1  Recovery rate and withinday and betweenday precision

　　2.6  质控样品的监控
    
　　按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度（50、25、1  μg·L-1）血浆样品，置-20 ℃冻存，备用，此即为质控样品。每天检测血浆样品前按照“2.3”项方法制作随行标准曲线及检测高、中、低3种浓度双份质控样品，如果相对回收率均在85%～115%（低浓度可在80%至120%之内）内时，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。

　　2.7  临床检测
    
　　104例精神分裂症患者，男性84例，女性20例，年龄18～81岁，平均（39±14）岁，连续服药14 d单次口服剂量（5±4）mg·d-1，测得稳态血药浓度为（6.98±5.50）μg·L-1，有效病例血药浓度为（8.70±5.90）μg·L-1。

　　3  讨论

　　3.1  笔者选用ESI对利培酮分别进行离子扫描和碎片离子扫描，选择的离子对（m/z 411→191）与文献［6］报道相似。再对干燥气流速、干燥气温度、雾化气压力、毛细管电压，以及四级杆停留时间、裂解电压和裂解能量等质谱条件进行优化。同法优化内标拉莫三嗪的质谱条件。与其他分析方法相比，本文所建立的LCESIMS/MS法显示了较强的抗干扰优势，由于采用了SRM扫描方法，病人联用的其他药物组分，如氯氮平、氯丙嗪、安坦、地西泮等，均不干扰待测物的测定。

　　3．2  笔者分别试用乙醚、正己烷、醋酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和醋酸乙酯二氯甲烷为提取剂，经过比较发现在醋酸乙酯二氯甲烷（体积比4∶1)中的提取率最高，故采用此混合溶剂作为提取剂。

　　3．3  经过对替米沙坦、度洛西汀、拉莫三嗪等药物的比较发现，利培酮与拉莫三嗪提取条件相似，且出峰时间相近，内源性物质不干扰，与拉莫三嗪联用几率小，故选择拉莫三嗪为内标物。有文献报道用苯海拉明［5］、喹硫平［6］作内标，临床上苯海拉明、喹硫平与利培酮有合并用药的病例，故改用合并用药可能性较少的拉莫三嗪作内标。检测定量限为0.5  μg·L-1低于文献［3］报道的4  μg·L-1。

　　3.4  笔者曾用高效液相联用离子阱质谱仪检测血浆中利培酮浓度，检测一个标本需要血浆1 mL，血浆处理后浓缩10倍，检测所需时间为5 min，本实验检测一个标本仅需0.2 mL，标本处理后无须浓缩，进样量少（2 μL），检测时间3.2 min，操作简单、快速，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，可作为临床常规利培酮的血药浓度监测及其药动学的研究。

【参考文献】
  　［1］ AVENOSO A,FACCIOLA G,SALEMI M,et al.Determination of risperidone and its major metabolite 9hydroxyrisperidone in human plasma by reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detection［J］.J Chromatogr B,2000,746(2):173-181.

　　［2］ BALANT GORGIA AE,Gex FABRY M.Therapeutic drug monitoring of risperidone using a new,rapid HPLC method: reappraisal of interindividual variability factors［J］.Ther Drug Monit,1999,21(1):105-115.

　　［3］ RAGGI MA，BUGAMELLI F，SABBIONI C，et al.HPLCDAD determination of plasma levels of the antipsychotic risperidone and its main metabolite for toxicological purposes［J］.J Sep Sci，2005，28（3）:245-250.

　　［4］ ZHANG G，TERRY AV J R，BARTLETT M G.Liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of olanzapine,risperidone,9hydroxyrisperidone,clozapine,haloperidol and ziprasidone in rat plasma［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2007，21（6）:920-928.

　　［5］ 段小涛，陈笑艳，张逸凡，等.液相色谱-串联质谱法测定人血浆中的利培酮［J］.药学学报，2006，41(7):684-688.

　　［6］ 苏芬丽，周志凌，李焕德.HPLCMS法检测利培酮与9羟利培酮的血浆浓度及在临床药动学的应用［J］.药物分析杂志，2006，26(2):207-211.