用碱性裂解法提取人血凝块中基因组DNA

    【摘要】  　　目的 建立一种新的从人血凝块中提取基因组DNA的方法。方法 血凝块于室温自然解冻，匀浆，碱消化，酚氯仿抽提，电泳检测。结果 用碱性裂解法从人血凝块中成功提取到基因组DNA，提取的DNA质量浓度平均为0.46g/L，且吸光度比值A260/A280>1.8，选取人Gpx1基因作PCR获得满意的目的片段。结论 用碱性裂解法提取的基因组DNA的总量较高，提取效率高，PCR扩增效果好，可很好的应用于血凝块基因组DNA的提取。

    【关键词】  血凝块；DNA提取；碱性裂解法

　　An alkaline lysis method for extracting genomic　DNA from human blood clot

　　Wang Xiaowei, Zhang Kezhou, Xiong Yongmin

　　(Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;Xian Yanliang 630 Rheumatosis Hospital, Xian 710089, China)

　　ABSTRACT: Objective  To explore a new method to isolate genomic DNA from human blood clot. Methods  Blood clot was thawed naturally in room temperature and homogenized, then digested with alkaline and extracted by phenol and chloroform, electrophoresis detection. Results  The genomic DNA was successfully extracted by alkaline lysis method. The average quantity of the extracted DNA was 0.46g/L, while A260/A280>1.8. PCR was performed using the human Gpx1 gene, and we obtained the needed target gene fragments. Conclusion  The alkaline lysis extraction method is reliable for obtaining high quantities of DNA from blood clot suited for PCR amplification.

　　KEY WORDS: blood clot; DNA extraction; alkaline lysis method

　　DNA的提取与纯化是分子生物学研究的基本方法，抗凝外周血是常用的DNA提取材料。目前，临床检验和流行病学调查所采集的血样常需分离血清作生化等分析，而血凝块常被丢弃。我们在三年前采集的一组近200例的临床标本，当时为保证与相关实验的一致性，均未抗凝处理，提取了血清进行相关研究，所剩血凝块于-70℃冰箱保存至今。应用常规方法提取血凝块中DNA产量低且不稳定，不能很好用于PCR等后续实验。有用碱裂解法从血痕提取DNA[1],但不适用于大量检材，不能很好应用于分子生物学实验，而且其试剂配制较繁琐。有用蛋白酶K提取血凝块中的染色体DNA[23]，但方法繁琐、耗时长且所用试剂较昂贵。碱性裂解法[4]原是从鼠趾中提取DNA片段的方法，但不能直接应用于从血凝块提取基因组DNA，我们遂对其反应条件进行了重新摸索及改进，经反复大量试验，最终确立了从大量血凝块中提取基因组DNA的方法，简便易行，结果稳定。

　　1  材料与方法

　　1.1  样品  血凝块来自西安交通大学医学院地方病研究所3年前采集的临床标本，血清分离后于-70℃冰箱保存至今。

　　1.2  试剂

　　1.2.1  裂解液  50mmol/L NaOH溶液(国产分析纯)。

　　1.2.2  中和液  1mol/L TrisHCl 溶液(pH8.0)(进口分装)。

　　1.2.3  提纯液  酚氯仿(V∶V＝24∶1)(酚：中国医学科学院生物工程研究所；氯仿：天津化学试剂三厂)，无水乙醇(西安化学试剂厂)。
　　
　　1.2.4  DNA溶解液  1×TE buffer(EDTA：西安化学试剂厂)。

　　1.3  提取方法  取血凝块标本于室温条件下自然溶解，匀浆(可加适量生理盐水，也可不加)，取0.5mL匀浆液(不同剂量标本其相应试剂用量按比例计算即可)于1.5mL Eppendorf管中；加入500μL 50mmol/L NaOH溶液，充分混匀后于60℃保温10min；然后加入50μL 1mol/L TrisHCl溶液(pH8.0)，充分混匀后于4℃ 12000r/min离心10min；取上清于另一Eppendorf管，加入等体积的酚氯仿溶液(酚氯仿溶液用前摇匀一下以取得更好分离效果)，充分混匀后4℃ 12000r/min离心10min；小心取上清于另一Eppendorf管，加两倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后于4℃ 12000r/min离心10min；弃上清，在室温条件下干燥15min后加入100μL 1×TE buffer充分溶解；最后将DNA溶液放置于-20℃冰箱保存备用，保存3个月以上则应放入-70℃冰箱。

　　1.4  检测

　　1.4.1  电泳  采用琼脂糖凝胶电泳，电泳液为0.5×TBE，配制10g/L 8孔的琼脂糖凝胶，第1、8孔各加DNA Marker DL2000 5μL，第2-6孔加提取的DNA样品(各5μL样品＋1μL DNA loading buffer)，第7孔加λHind Ⅲ digest DNA Marker(电泳前进行60℃热处理5min消除COS末端的结合情况)5μL。
   
　　在110V电压下电泳80min，凝胶成像系统GDS8000，302nm紫外光下摄像。

　　1.4.2  NanoDrop  ND1000紫外分光光度计自动检测浓度及纯度。

　　1.4.3  PCR扩增人Gpx1基因并进行电泳检测  扩增人的Gpx1基因并电泳检测扩增产物，引物序列：上游引物5′TGTGCCCCTACGCAGGTACA3′；下游引物5′CCAAATGACAATGACACAGG3′。
   
　　PCR反应体系为50μL：引物各1μmol/L，dNTP 0.2mmol/L，1u Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer(Mg2＋plus)5μL，模板DNA 1μL。PCR反应条件：预变性95℃ 3min，变性95℃ 30s，退火58℃ 60s，延伸72℃ 90s，共进行40个循环，最后72℃延伸10min。电泳液为0.5×TBE，配制20g/L 8孔的琼脂糖凝胶，第1、8孔加DNA Marker DL2000，第1-6加PCR产物。电泳条件：120V 35min。

　　2  结果

　　2.1  人血凝块提取的DNA电泳凝胶成像  提取DNA后，溶解于1×TE buffer(pH8.0)，取5μL溶液作琼脂糖凝胶电泳检测，显示从血凝块中提取的人染色体DNA分子集中在20Kbp左右(图1)，条带清晰，无明显拖带，这样的大分子DNA完全能够满足PCR扩增的需要。

　　图1  提取DNA 10g/L琼脂糖凝胶电泳结果（略）

Fig.1 10g/L agarose gel analysis of the extracted DNA

　　M1: DNA Marker DL2000; M2: λHind Ⅲ digest DNA marker; 1-5 (2-6 well): DNA sample

　　2.2   分光光度计检测结果  提取的DNA质量浓度平均为0.46g/L，且所有吸光度比值A260/A280>1.8。

　　2.3  人Gpx1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果  目的片段长度337bp(图2)。

　　图2  人Gpx1基因PCR产物电泳结果（略）

　　Fig.2 The amplification results of human Gpx1 gene PCR products analyzed on 20g/L agarose gel

　　M: DNA Marker DL2000;  1-6 (2-7 well): PCR product

　　3  讨论
   
　　根据不同的目的，基因组DNA可以从组织块或体液中提取。临床上常用抗凝外周血作为DNA提取材料，常于取血时加入枸橼酸钠或EDTA抗凝，而保存较长时间后仍然可能产生血块，给提取带来困难，而弃掉许多珍贵的甚至以后很难再搜集到的临床标本，造成浪费。
   
　　强碱对蛋白质有强烈的变性、裂解作用，可使半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸残基等细胞蛋白质成分迅速解离，蛋白质一级结构被快速破坏[1]。在强碱性和一定温度条件下，细胞膜及核膜迅速破裂，核蛋白及核酸酶变性，DNA释放。在合适的条件下，DNA的一级结构可以保持相对完整，使抽提基因组DNA成为可能。在此理论基础之上，参考国外文献，我们建立了一种新的从大量血凝块提取基因组DNA的碱性裂解法，结果表明提取的基因组DNA的总量较高，提取效率高， PCR扩增效果好，可很好的应用于血凝块基因组DNA的提取。
   
　　该方法相对于现有的DNA提取方法具有以下优点：所收集的标本均不含抗凝剂，标本处理简化，可以消除抗凝剂成份对后来扩增结果的影响。可同时保留血清和血凝块，使宝贵的血液资源充分利用，同时满足临床及分子生物学实验的要求，避免了血凝块被丢弃造成的浪费，而且标本易于保存，能够充分利用所拥有的血液标本，并且可以与血清检测结果相对应，避免研究过程中因标本采集时间不同而造成的分析误差。实验试剂配制容易，实验操作过程简单明了，并免去了应用昂贵的试剂如蛋白酶K，免去水浴过夜操作，节省了人力、物力和时间，降低了实验成本。本方法可从大量血凝块中提取基因组DNA应用于科学研究，从而为临床采集标本提取DNA提供了一条新的途径。
   
　　致谢：感谢吕社民教授在实验过程中给予的指导和帮助。

【参考文献】
  　[1]刘翠兰，胡家伟. 碱性裂解法提取法医学生物检材DNA及法医学应用 [J]. 中国法医学杂志, 2001, 16(2):102104.

　　[2]陈立，姜莉，罗阳，等. 一种从血凝块中提取基因组DNA的方法 [J]. 细胞生物学杂志, 2004, 26:548549.

　　[3]何欣，孙哲，郭涛，等. 血凝块DNA提取方法探讨 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2006,41(1):5657.

　　[4]Peter Olofsson, sa Johansson, Dirk Wedekind, et al. Inconsistent susceptibility to autoimmunity in inbred LEW rats is due to genetic crossbreeding involving segregation of the arthritisregulating gene Ncf1 [J]. Genomics 83, 2004:765771.