伴与不伴远处转移乳头状甲状腺癌患者血清的差异蛋白质组学分析及筛选模型的建立

作者                    作者单位

许艳红    215006　江苏省，苏州大学研究生部；上海交通大学附属第六人民医院核医学科

宋红俊    上海交通大学附属第六人民医院核医学科

邱忠领    上海交通大学附属第六人民医院核医学科

罗全勇    上海交通大学附属第六人民医院核医学科

【Abstract】　Objective　To compare differentially expressed proteins between papillary thyroid carcinoma (PTC) patients with distant metastasis and PTC without distant metastasis，and establish the predictive models that may be of help to serologic diagnosis of papillary thyroid carcinoma (PTC) with distant metastasis.Methods　Serum samples were collected from 36 PTC patients with distant metastasis and 29 PTC patients without distant metastasis，and randomized into a modelling set (26 PTC patients with distant metastasis and 19 PTC patients without distant metastasis) and a blinding test set (10 PTC patients with distant metastasis and 10 PTC patients without distant metastasis).Serum samples were applied to immobilized metal affinity capture (IMAC3) proteinchip surfaces and tested by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry (SELDI-TOF-MS).The data were analyzed by Ciphergen Proteinchip 3.1 software to screen differentially expressed proteins between PTC with distant metastasis and PTC without distant metastasis.Decision classification tree models were established by bioinformatics.Doubled-blind test was used to determine sensitivity and specificity of the classification tree models.Results　A total of 69 effective protein peaks were detected at the molecular range of 1.5 ku to 20 ku，among which 10 were significantly different between PTC with distant metastasis and PTC without distant metastasis(P<0.05).All the peptide data in the training set were used to obtain decision tree models.Thetree with highest cross validation rate was chosen to construct the classification models which can different PTC patients with distant metastasis from PTC patients without distant metastasis.With this decision tree,16 cases were correctly forecasted from 20 blind testing samples，with a sensitivity of 80% and a specificity of 80%.Conclusions　The serum protein profiles between PTC with distant metastasis and PTC without distant metastasis were differential and the predictive models can discriminate PTC with distant metastasis from PTC without distant metastasis effectively.

【Key words】　Thyroid neoplasms;　Carcinoma，papillary;　Proteomics;　Neoplasm metastasis;　Surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry

乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)约占分化型甲状腺癌的90%。是否存在远处转移(肺、骨转移等)是影响其预后的主要因素[1]，虽然PTC一般预后良好，但一旦发生远处转移后，预后则较差[2]。若能提前预测PTC是否易于发生远处转移，并据此进行治疗决策，无疑对提高患者的临床缓解率和长期生存率具有帮助。但是目前尚无有效预测PTC是否易于发生远处转移的方法。因此，探索一种有效预测PTC是否易于发生远处转移的方法十分必要。为此，本研究对伴与不伴远处转移的PTC患者进行血清差异蛋白质组学研究，筛选二者血清的差异蛋白质，并据此建立决策树模型，以预测PTC的远处转移性，为评价PTC的临床恶性程度提供参考和帮助。

材料与方法

一、研究对象

65例PTC患者血清来源于上海交通大学附属第六人民医院2008～2009年住院病例，其中不伴远处转移PTC 29例，伴远处转移PTC 36例。分别抽取清晨空腹前臂静脉全血 5 ml。从65例样本中随机取出45例样本(26例为伴远处转移PTC,19例为不伴远处转移PTC)作为建模型组，20例样本(10例为伴远处转移PTC,10例为不伴远处转移PTC)作为盲法筛选组。

二、 试剂与仪器

乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)、3-环己胺-1-丙磺酸(CHARPS)均购自Sigma公司，固定金属亲和表面(immobilized metal affinity capture，IMAC3)蛋白芯片和蛋白质芯片阅读机(PBSⅡc型)、Ciphergen Proteinchip 3.1软件购自美国Ciphergen公司。

三、方法

1. 血清标本制备：PTC患者外周静脉血采集后室温静置2 h后，3000 r/min离心15 min(离心半径8.6 cm)，取血清，20 μl/管分装后置于-80 ℃冰箱保存备用。使用时取出分装的血清样品，冰上融化，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min(离心半径19.7 cm)，除去血清中的不溶物。

2. IMAC3-Cu检测：(1)芯片活化：取100 mmol/L 的 CuSO4溶液，按每孔 10 μl 加入芯片加样孔中，湿盒中摇2次，每次10 min。吸去CuSO4后，用去离子水洗3次。再每孔加入50 mmol/L(pH 4.0)的NaAc 10 μl，湿盒中摇2 min。吸去NaAc后，去离子水洗3次。(2)芯片平衡：将芯片装入生物芯片处理器中，每孔加入200 μl NaCl浓度为500 mmol/L 的 PBS(pH 7.2)，室温摇2次，每次5 min。(3)血清样品稀释：取6 μl 血清样品，加入234 μl NaCl 浓度为500 mmol/L的PBS(pH 7.2)混匀稀释。(4)芯片上样：取稀释后的血清样品，按每孔200 μl 加入平衡好的芯片加样孔中，置芯片于摇床孵育90 min。(5)样品洗脱：取NaCl浓度为500 mmol/L 的PBS(pH 7.2)，按每孔200 μl加入芯片加样孔中，洗脱2次，每次5 min。每孔加入300 μl 的去离子水冲洗芯片。(6)蛋白质获能：取能量吸收剂SPA(饱和芥子酸溶于50%乙腈和0.15%三氟乙酸)，按每孔0.5 μl加入芯片加样孔中，待自然挥发后再重复加SPA 1次。(7)芯片检测：将芯片置入蛋白芯片阅读机中，将加有All-in-one 标准蛋白质的NP20芯片仪器校正至0.1%范围内。芯片阅读仪参数设置如下：激光强度165，检测灵敏度7，优化范围1000～10 000，最高分子量30 000，芯片上的每个点采集170次。用Ciphergen Proteinchip 3.1 软件收集数据，画坐标图，其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。

3. 统计学分析： 用Ciphergen Proteinchip 3.1软件计算相同M/Z的蛋白质在伴远处转移PTC组与不伴远处转移PTC组间峰值差异的P值。根据wilcoxon sum rank test 统计分析的原理计算总图谱内伴远处转移PTC组与不伴远处转移PTC组相同M/Z蛋白质表达差异的P值。以Excel表输出差异表达蛋白的分子量和相对强度。

结　　果

1. 与PTC远处转移相关的差异表达蛋白：PTC患者伴与不伴远处转移的血清蛋白指纹图谱经标准化后，用Ciphergen Proteinchip 3.1软件对两组患者血清中蛋白质峰的数量和相对强度进行分析比较。在分子量为 1.5～20 ku 的范围内共检测到69个蛋白质峰，其中10个蛋白质峰的差异有统计学意义(P<0.05)。其中1个蛋白质峰(M/Z=11403.40)在伴有远处转移PTC组呈高表达，9个蛋白质峰在不伴远处转移PTC组呈高表达(表1)。在不伴远处转移PTC组呈明显高表达的 1蛋白质峰(M/Z=9088.04)的质谱图见图1。表1　伴与不伴远处转移PTC患者血清差异表达蛋白质峰的比较蛋白质差异峰,M/Z,相对峰强度

2. PTC远处转移预测模型的建立：建模组经过500次的交叉验证，从中选出交叉证实准确率最高的1个决策树模型作为“PTC伴与不伴远处转移”分组筛选的最优决策树模型(图2)。

3. 盲法预测：用上述的最优决策树模型对盲法筛选组的20个预测样本进行预测。预测方法为：以预测样本中的样本DM2为例，预测结果认为该样本属于伴远处转移PTC，实际上该样本就来自伴远处转移PTC组，为预测正确。若预测结果认为该样本属于不伴远处转移PTC，而实际上该样本来自伴远处转移组，为预测错误。结果16例被准确预测和分组。该盲法验证的灵敏度为80%(8/10)，特异度为80%(8/10)，预测正确率为80%(16/20)。

讨　　论

蛋白质组学认为恶性肿瘤是一种蛋白质缺陷病，其发生发展过程中会出现多种蛋白质分子，如各种生长因子和酶都可能成为潜在的肿瘤标记物。蛋白质组学技术可以筛选肿瘤不同阶段中表达的各种蛋白质，尤其是与肿瘤相关的低丰度蛋白质，从而发现众多的标记物，联合多种标记物筛检将有望提高肿瘤诊断的特异性与敏感性，检测蛋白质谱的变化可以更准确地判断肿瘤的发生与发展进程[3]。任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，所以，通过对蛋白质的动态检测，可以检测出疾病病理变化早期蛋白质的质和量的变化[4]。表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片技术对于检测成分复杂的血清蛋白质尤为合适[5]。SELDI-TOF-MS技术集质谱技术和芯片技术于一身，整合样品的分离、纯化、生化反应和检测分析为一体[6]，能同时检测标本中大量的蛋白质分子，已逐步用于肿瘤标记物的筛查和临床检测[7]。SELDI-TOF-MS技术作为一种蛋白质组学技术，具有以下优势：(1)待测样本来源广，如血清、尿液、体液、脑脊液、细胞培养液、组织提取物等，不需要特殊处理，便可直接点样进行检测分析;(2)样品用量极少，每次分析只需要0.5～5.0 μl或2000个细胞的超微量样本;(3)可检测的分子量范围很广，且特别适合于分析分子量20 kD以下的蛋白质，而这一范围是二维凝胶电泳分析的弱项;(4)可进行小样本实验与高通量检测的自由选择，每次可测8、24、96或192个样品，可满足临床检测、普查或大样本筛查的需要;(5)检测速度快，通常完成一条8孔芯片的阅读时间仅为3～5 min，可快速获取实验结果;(6)携带的分析软件可以迅速发现各种疾病特异性变化的差异蛋白质，用于发现与疾病相关的一种或一组生物标记物，提供疾病诊断的最佳组合指标;而二维电泳胶上的蛋白质斑点往往包含一种以上的蛋白质分子[8-9]。

应用SELDI-TOF-MS技术研究甲状腺癌蛋白质组学的文献报道十分有限。卢秀波等[10]采用弱阳离子交换(weak cation exchange，WCX2)芯片检测甲状腺癌、甲状腺良性结节和正常人血清中蛋白质组图谱，建立了甲状腺癌早期诊断的血清蛋白质指纹图谱模型;王稼祥等[11]采用WCX2芯片检测PTC和甲状腺良性结节、PTC和正常人血清中蛋白质组图谱，发现不同病理类型和不同阶段的甲状腺癌血清中蛋白质组图谱存在明显差异。Fan等[12]采用WCX2芯片检测PTC和正常人血清中蛋白质组图谱，建立了PTC的血清诊断模型。

目前SELDI-TOF-MS技术采用的芯片有多种，不同的芯片由于其表面结合的介质不同，其捕获的蛋白也不同。本研究采用的IMAC3芯片其表面结合有亚硝基，它可以螯合金属离子(如Cu，Ni，Ga等)，加到芯片表面结合点上的蛋白质通过半胱氨酸和色氨酸位点上的磷酸化氨基酸等与金属离子结合，主要用于检测磷酸化蛋白及生物标记分子[13]。迄今为止，尚无采用IMAC3芯片进行甲状腺癌蛋白质组学研究的相关报道。由于PTC占分化型甲状腺癌的绝大部分，为此，本研究选取PTC患者作为研究对象，首次对PTC伴与不伴远处转移患者的血清蛋白质组表达差异进行了研究，并建立了相关筛选模型。

综上所述，本研究采用SELDI-TOF-MS技术，筛选和比较了伴与不伴远处转移PTC患者血清的蛋白质谱表达差异，发现M/Z=11403.40的蛋白质峰可能与PTC远处转移有关;并在此基础上建立了具有较高灵敏度和特异性的筛选模型，这对预测和筛选PTC的临床生物学行为，特别是侵袭性与远处转移能力等有重要临床价值和应用前景。

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