维持性血液透析患者肝素-血小板因子4抗体的相关研究

作者                作者单位

刘新宇   中山大学附属第五医院血液净化中心,广东珠海,519000

李宓     中山大学附属第五医院血液净化中心,广东珠海,519000

苏明     中山大学附属第五医院血液净化中心,广东珠海,519000

周文英   中山大学附属第五医院血液净化中心,广东珠海,519000

【Abstract】　Objective　To evaluate the level of anti-heparin/platelet factor 4 (AHPF4) antibodies in maintenance hemodialysis (MHD)patients receiving heparin administration，and therefore to study the relationship between AHPF4 antibody and thrombosis in vascular access in MHD patients，and to figure out the presenting time of AHPF4 antibody in MHD patients receiving either heparin or low molecular weight heparin administration as anticoagulant.Methods　A total of 148 patients were selected from two blood purification centers,74 cases from each center and all of them receiving maintenance hemodialysis and heparine administration as anticoagulant for at least 3 months.AHPF4 antibody was measured by means of ELISA.Then the 74 cases in one center were switched to low molecular weight heparin administration and acted as Group L，while the other 74 cases in another center still receiving heparin administration and acted as Group H.All cases with positive AHPF4 antibody received follow-up evaluation of the antibody two and four months later.Results　The positive rate of AHPF4 antibody was 8.1% in the 148 MHD patients receiving heparin administration as anticoagulant.By means of retrospective analysis，there was a statistical difference in the incidence of access thrombosis between AHPF4-positive and negative cases during the past two years，P<0.05.Five patients in Group G were AHPF4 antibody-positive before grouping and four of them remained positive after two and four months.Seven patients in Group L were AHPF4 antibody-positive before grouping and remained positive two months later.While one case turned to be negative four months later.Thenumber turned out to be six after four months.Conclusions　(1)The positive rate of AHPF4 antibody in MHD patients receiving heparin administration as anticoagulant was 8.1%.(2)AHPF4 antibody-positive MHD patients had a higher incidence of access thrombosis during the past two years，compared to AHPF4 antibody-negative MHD patients.(3)AHPF4 antibody will not completely disappear in MHD patients either maintained in heparin administration or switched to low molecular weight heparin administration as anticoagulant in a short term (four months).

【Key words】　Renal dialysis;　Platelet factor 4;　Thrombocytopenia;　Heparin，low-molecular-weight;　Thrombosis

肝素及低分子肝素是目前临床上应用最广泛的抗凝药物[1]。肝素使用过程中可以通过免疫介导产生肝素-血小板因子4(anti-heparin/platelet factor 4，AHPF4)抗体，从而可引起血小板活化、聚集和血小板减少，称为肝素诱导的血小板减少症(heparin-induced-thrombocytopenia，HIT)[2]，部分患者可并发血栓形成[3]。

维持性血液透析(MHD)患者大多会持续使用肝素或低分子肝素，同样可能形成AHPF4抗体、发生HIT以及增加发生血管通路栓塞的风险。而反复的血管通路栓塞是MHD患者死亡率增加的主要原因之一[4]。AHPF4抗体与MHD患者血管通路栓塞的关系国内外均有研究，但目前观点不一。AHPF4抗体在MHD患者中存在时间目前鲜见报道。本研究的目的是了解AHPF4抗体在持续使用肝素抗凝的MHD患者中的发生情况、抗体与MHD患者血管通路栓塞事件的关系、抗体在持续使用肝素或低分子肝素抗凝的MHD患者体内存在的时间。

资料与方法

1. 一般资料：2009年9～10月选择在中山大学附属第五医院血液净化中心及江门市中心医院血液净化中心已规律血液透析3个月以上且自开始透析来一直采用肝素作为抗凝剂的患者各74例，共148例。其中男89例，女59例，平均年龄(50.9±15.0)岁。原发病为慢性肾小球肾炎52例，糖尿病肾病16例，高血压肾病24例，梗阻性肾病15例，多囊肾4例，IgA肾病4例，其他16例，原因不明17例。所选患者近期无明显感染史、无手术及创伤史、无心力衰竭、无黄疸、无高脂血症、无溶血，并愿意接受此项研究。

2. 分组：在检测完AHPF4抗体后将研究对象再分为肝素组(G组)及低分子肝素组(L组)。G组：江门市中心医院血液净化中心研究对象在检测完抗体且排除为HIT后继续使用肝素抗凝。试验期间患者如出现出血倾向等不耐受肝素情况时暂使用无肝素透析，待稳定后继续使用肝素抗凝。L组：中山大学附属第五医院(珠海)血液净化中心研究对象，在检测AHPF4抗体且排除为HIT后经征求患者同意由原来的肝素抗凝改为低分子肝素进行抗凝，改用低分子肝素后患者增加的费用由本试验经费承担。试验期间患者如出现出血倾向等不耐受低分子肝素情况时暂使用无肝素透析，待稳定后继续使用低分子肝素抗凝。

3. 试验方法：G组与L组患者均每周透析2～3次，每次4.0～4.5 h;使用Baxter CT-190G透析器，动静脉内瘘或中心静脉导管血管通路，血流量200～300 ml/min，普通肝素或低分子肝素抗凝，透析液流量为500 ml/min，碳酸氢盐透析。同时记录干体重、超滤量、透析时间、上机前血压、肝素剂量、每周的促红细胞生成素(EPO)用量。既往血管通路栓塞事件的记录：从患者病史中了解从开始透析至今所发生的血管通路栓塞事件及其发生的时间。基本项目检测：透析前检测白蛋白、尿素氮。透析中2 h检测血红蛋白、红细胞压积、血小板计数，透析后检测尿素氮。AHPF4抗体的检测：标本收齐后统一用酶联免疫法(ELISA)进行检测[按试剂说明书检测采用复孔，计算吸光度值(OD值)时取平均数，OD值≥0.9为阳性标准]。G组与L组于2个月及4个月后分别重新抽取一次AHPF4抗体阳性的12例患者血标本。前后3次标本(0个月、2个月、4个月)放在同一个酶联板上，所测抗体的OD值进行对照。了解G组与L组AHPF4抗体滴度随时间的变化。

4. 统计学分析：采用SPSS 11.0统计软件包对试验结果进行处理，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1. 所有患者AHPF4抗体的发生情况：两个血液净化中心所有148例采用肝素抗凝的MHD患者中测得AHPF4抗体阳性患者12例，其中江门中心医院血液净化中心5例，中山大学附属第五医院血液净化中心7例，抗体阳性率为8.1%。所有AHPF4抗体阳性患者均不伴有血小板减少症，故均不能诊断为HIT，而仅为隐形HIT[5](仅AHPF4抗体阳性)。

2. AHPF4抗体阳性组与阴性组相关指标的比较(表1)：所有AHPF4抗体阳性组和抗体阴性组在年龄、性别、透析时间、原发病、是否合并糖尿病、干体重、血流量、血压、超滤量、肝素剂量、EPO量、白蛋白、血红蛋白、红细胞压积、血小板、Kt/V值、既往血管通路栓塞事件方面相比差异均无统计学意义(P>0.05)，而2年内的血管通路栓塞事件相比差异有统计学意义(P<0.05) 。

3. G组与L组AHPF4抗体随时间的变化(表2)：G组在分组前AHPF4抗体阳性有5例，2个月及4个月后复查仍有4例为阳性。L组在分组前AHPF4抗体阳性有7例，2个月后复查仍有7例为阳性，4个月后复查6例阳性。表1　AHPF4抗体阳性组和抗体阴性组相关指标的比较表2　G组与L组AHPF4抗体OD值随时间的变化情况

讨　　论

1. MHD患者AHPF4抗体的发生率：本试验使用特异性IgG PF4-H ELISA法检测得出使用肝素抗凝的MHD患者AHPF4抗体的阳性率为8.1%。以往报道的对于终末期肾功能衰竭MHD患者使用ELISA法检测的抗体发生率在3%～12.9%[6]。各报道阳性率差异的原因主要在于：(1)使用不同的ELISA检测方法：AHPF4抗体包括IgG、IgM和IgA三种，其中80%为IgG(伴或不伴IgM和IgA)，IgG是引起HIT患者血小板活化的主要抗体[7]。如果使用特异性IgG PF4-H ELISA检测则测得的发生率较低。(2)使用低分子肝素则AHPF4抗体的发生率较低。因为肝素和血小板4因子(PF4)四聚体之间摩尔浓度比接近1∶1时能形成超大复合物(ultralarge complex，ULC)(>670 kU)。ULC性质稳定且抗原性强，对于免疫介导的AHPF4抗体形成、抗体引起的血小板活化及血栓形成等方面都有更强的促进作用。而低分子肝素由于很难与PF4结合形成ULC，所以引起AHPF4抗体及相应的HIT的概率均较低[8]。本试验测得抗体的发生率为8.1%，与以往的报道相符。

2. AHPF4抗体阳性与血管通路栓塞的关系： AHPF4抗体与MHD患者血管通路栓塞的关系一直是研究的热点问题。AHPF4抗体导致血栓形成除了主要与血小板活化和血小板凝集有关外，还有以下多种机制：(1)AHPF4抗体在PF4存在的前提下与血管腔内侧内皮细胞上的肝素样氨基葡聚糖结合引起免疫复合物介导的内皮损伤，同时刺激内皮细胞释放组织因子，激活外源性凝血途径，促进血栓形成[9]。(2)AHPF4抗体在PF4存在条件下可以与外周血单核细胞结合，激活单核细胞，促进合成和分泌组织因子以及致炎细胞因子IL-8，并引起细胞表面促凝活性增强，促进血栓形成。这可能是由于单核细胞表面也存在肝素样氨基葡聚糖[10]。(3)活化血小板释放的PF4，可以中和肝素的抗凝作用，从而出现临床上的肝素抵抗。

但临床试验中关于AHPF4抗体与血管通路栓塞是否有直接的相关性目前仍有争议：Lee等[11]学者以91例MHD慢性肾功能衰竭患者为研究对象，结果表明AHPF4抗体阳性的MHD患者血管通路阻塞的发生率显著高于抗体阴性组;Carrier等[6]对419例MHD患者进行大样本的研究，研究对象分为两组，发生过血管通路栓塞的患者组(107例)和未发生过血管通路栓塞的患者组(312例)，回顾性分析研究表明AHPF4抗体与血管通路栓塞无关。

本试验采用回顾性分析，研究MHD患者AHPF4抗体与既往血管通路栓塞的关系：结果表明AHPF4抗体阳性MHD患者血管通路栓塞发生率与AHPF4抗体阴性患者相比差异无统计学意义。但进一步分析发现抗体阳性MHD患者既往2年内的血管通路栓塞发生率明显高于AHPF4抗体阴性患者。所以本试验得出以下结论：AHPF4阳性MHD患者既往2年内的血管通路栓塞明显高于AHPF4阴性患者。

分析AHPF4阳性MHD患者与近2年内的血管通路栓塞而不是更远期的栓塞事件有关的可能原因为：(1)MHD患者影响血管通路栓塞(主要是动静脉内瘘的堵塞)的因素很多，如患者本身的血管条件、长期透析对血管的损害、穿刺引起的内瘘感染和血肿、透析低血压、内瘘局部受压迫等[12]。透析的时间越长，发生内瘘堵塞等血栓事件的机会越大。所以AHPF4抗体在评估或预测远期的血管通路栓塞中所起的作用可能甚微。(2)AHPF4抗体在MHD患者体内产生后可能不会持久存在[13]。本试验对抗体在MHD患者中的存在时间也做了研究，结论为短期内(4个月)抗体不会消失，但抗体在体内是否长期存在及存在的时间仍有待进一步跟踪研究。如果抗体在患者体内存在一段时间后消失，则其引起的血栓风险也会极大地减少。

3. AHPF4抗体在持续使用肝素或低分子肝素抗凝的MHD患者中的存在时间：目前关于持续使用肝素或低分子肝素抗凝的患者中AHPF4抗体是否持续存在以及存在的时间尚未见文献报道。既往关于AHPF4抗体在体内存在时间的报道局限于已确诊为HIT的患者，这类患者在确诊为HIT后即已经停用肝素、低分子肝素或者改为不会继续产生AHPF4抗体的其他抗凝剂。如Warkentin等[13]曾统计了243例确诊为HIT的患者，发现AHPF4抗体持续时间较短暂(在HIT恢复过程中，已经停用肝素或低分子肝素)，AHPF4抗体平均在50～85 d内就已经无法测出。但本试验所测AHPF4抗体阳性的患者并不伴有血小板减少故不能诊断为HIT。而在MHD患者中，目前没有证据表明仅仅AHPF4抗体阳性就必须停用肝素、低分子肝素，所以肝素或者低分子肝素一般都可以持续使用，而无需停用或者换用其他的抗凝药(如阿加曲班、重组水蛭素、枸橼酸钠等)进行抗凝[14-15]，除非已经出现血小板进行性下降伴或不伴血栓形成[16]。故本试验研究了AHPF4抗体阳性的患者在持续使用肝素或低分子肝素抗凝情况下抗体在体内的持续时间。

本研究将第一次测得AHPF4抗体阳性的患者在2个月及4个月后留取血清进行复测。并且将前后三个时期的血清放在同一个酶标板中对OD值进行对照。发现抗体并不会在短期内消失，抗体的浓度也不是逐渐下降，有的抗体浓度反而会升高。但关于抗体是否会长期存在或者存在的时间范围有待下一步研究。另外从本研究可以看出对于单纯AHPF4抗体阳性的MHD患者换成低分子肝素抗凝后相比较继续使用肝素抗凝而言短期内并无明显优势。抗体浓度随时间波动的原因考虑为：(1)由于肝素或低分子肝素持续的使用，继续产生AHPF4复合物，进而刺激抗体不断产生。(2)AHPF4抗体的产生与体内肝素或低分子肝素与PF4的浓度比有关，如肝素和PF4四聚体之间摩尔浓度比接近1∶1时才能形成ULC而表现出强抗原性，故体内相关物质的浓度波动均会影响抗体产生。另外有研究发现，既往有HIT病史的患者在抗体消失后再次使用肝素，抗体不一定会再次形成，也不一定会再发HIT [17]，其机制尚不明确，可能与上述的浓度比改变有关。总之，在持续使用肝素或低分子肝素的患者中，AHPF4抗体持续存在时间问题以及相关机制尚需进一步研究。

综上所述，肝素或低分子肝素是MHD中普遍使用的抗凝剂，但使用过程中会产生AHPF4抗体，AHPF4抗体与MHD患者的血管通路栓塞存在一定的联系。抗体产生后如继续使用肝素或低分子肝素，抗体在短期内也不会完全消失。虽然相关研究目前还不完善，但在血液净化临床工作中，使用抗凝剂时要重视此类问题。

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