柴胡对肝星状细胞c-fos和c-jun基因表达的影响

小柴胡汤治疗急性肝炎为人们所熟知,柴胡及其有效成分在慢性肝病中的作用亦渐为人们所认识n-37我们既往的研究表明中药柴胡对肝星状细胞细胞外基质(ECM)、基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)的表达有明显的调节作用,其机制尚不清楚.我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察柴胡对肝星状细胞c-fns和c-jun基因表达的调节作用.
　　材料与方法
　　1.材料:柴胡由江苏江阴天江制药公司生产的颗粒配制而成,以含5%胎牛血清(FBS)的1640培养液稀释至16留L,经0.朽微孔滤膜过滤,置4℃冰箱储存备用.临用时,以含5%FBS的1640培养液稀释至不同浓度.DMEM培养基购自美国Sigma公司;总RNA提取试剂盒、AMV逆转录酶,RNA酶抑制剂、Olig(dt)15Primers,Tag酶、PCRMarker均为美国Promega公司产品.美国SHEL-LABC02细胞培养箱;美国Idaho毛细管PCR仪;美国KodakdigitalsciencesystemDCVO凝胶成像系统.肝星状细胞株HSC-T}4}:美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授惠赠.
　　2.肝星状细胞培养:肝星状细胞株HSC-T复苏后接种于塑料培养瓶中,用含5%DMEM的培养液在COz孵箱中培养.HSC-T细胞将近长满培养瓶底时分别换用含不同浓度柴胡(终质量浓度1.0,0.5g/L)的培养液,同时设空白对照组.各组于8,24,4歇72h4个时间点分别收集细胞,少量用于细胞计数及存活率检测,余迅速投入液氮,此后转人一700G保存.每组每个时间点均平行培养6瓶.
　　3.肝星状细胞总RNA的提取及cDNA的合成:用Promega公司生产的TotalRNAIsolationSystem提取肝星状细胞总RNA}RNA提取工作在标本留取后1周内进行.采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度,吸光度(Azw/Azao)值需在1.8一2.0.采用25闪逆转录反应体系合成cDNA;含待测RNA2},g,AMV30U,RNA酶抑制剂40U,Oligdt(15Primer)50m岁L及适量dNTP(10mmol/L),5xRT缓冲液,42℃反应1h;95℃5min灭活AMVo4.c-fos,c一un引物序列、共扩增PCR及扩增产物定量分析:参照我们已报道的方法进行〔5-705.统计学方法:结果以均数士标准差(x士、)表示,应用SPSS10.0统计软件分析,采用单因素方差分析.
　　结果
　　1柴胡对HSC-T细胞c-fos基因表达的影响(表1):可见对照组HSC-T细胞有c-fos的基因表达,8h时为最高峰,后随培养时间延长逐渐下降.柴胡两组HSC-T细胞c-fos基因表达水平在8,24,48,72h4个时间点均低于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-fos基因表达水平逐渐降低;两组间差异有统计学意义(P<0.O1).
　　2.柴胡对HSC-T细胞c-jun基因表达的影响(表2):可见对照组HSC-T细胞有c一un的基因表达,8h时为最高峰,后随培养时间延长逐渐下降.柴胡两组HSC-T细胞c-jun基因表达水平在8,24,48,72h4个时间点均显著低于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-Jun基因表达水平逐渐降低;两组间差异也有统计学意义(P<0.01).
　　讨论
　　近来的研究表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的发生、发展中发挥了重要作用;它不仅是肝脏中ECM的主要细胞来源,同时也是MMPs及其TIMP.的主要细胞来源.有研究表明中药复方861合剂对肝星状细胞ECM,MMPs,TIMPs的表达有明显的调节作用[8-91.柴胡作为复方861合剂中的主要药物之一.本研究结果显示,加人柴胡的两组HSC-T细胞.-fos,cjun基因表达水平在8,24,48,72h4个时间点均明显低于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-fos,c-jun基因表达水平逐渐降低;两组间差异有统计学意义.本研究结果提示柴胡对肝星状细胞c-fos和c-jun基因表达有明显的下调作用.
　　柴胡调控肝星状细胞c-fns,cjun基因表达的机制目前尚不清楚,尚有待进一步研究.
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