黄芪对肝星状细胞c-fos和c-jun基因表达的调节

近年来具有益气功能的中药黄茂在防治肝纤维化中的作用已被证实.有研究表明中药黄蔑对肝星状细胞细胞外基质(ECM)、基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)的表达有明显的调节作用,其机制尚不清楚.我们采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法观察黄蔑对肝星状细胞.-fO5和c-jun基因表达的调节作用,现报道如下.
　　材料与方法
　　1.材料:黄茂由江苏江阴天江制药公司生产的颗粒配制而成,以含5%胎牛血清(FBS)的1640培养液稀释至16舒L,经0.45微孔滤膜过滤,置_4℃冰箱储存备用.临用时,以含5%FBS的1640培养液稀释至不同浓度.DMEM培养基购自美国Sigma公司;总RNA提取试剂盒、AMV逆转录酶,RNA酶抑制剂、Olig(dt)15Primers,Tag酶、PCRMarker均为美国Promega公司产品.美国SHEL-I,ABCOz细胞培养箱;美国Idaho毛细管PCR仪;美国KodakdigitalsciencesystemDC.凝胶成像系统.肝星状细胞株HSC-T}z}:美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授惠赠.
　　2.月干星状细胞培养:肝星状细胞株HSC-T复苏后接种于塑料培养瓶中,用含5%DMEM的培养液在COz孵箱中培养.HSC-T细胞将近长满培养瓶底时分别换用含不同浓度黄茂(终质量浓度i.0,0.5g/L)的培养液,同时设空白对照组.各组于8,24,48,72h4个时间点分别收集细胞,少量用于细胞计数及存活率检测,余迅速投人液氮,此后转人一70℃保存.每组每个时间点均平行培养6瓶.
　　3.肝星状细胞总RNA的提取及cDNA的合成:用Promega公司生产的TotalRNAIsolationSystem提取肝星状细胞总RNA}RNA提取工作在标本留取后1周内进行.采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度,吸光度(人}o/Azao)值需在1.8一2.0.采用25闪逆转录反应体系合成cDNA;含待测RNA2},g,AMV30U,RNA酶抑制剂40U,Oligdt(15Primer)50m剔L及适量dNTP(10mmol/L),5xRT缓冲液,42℃反应1h;950C5min灭活.AMV4.c-fO5,c-jun引物序列、共扩增PCR及扩增产物定量分析:参照我们已报道的方法进行.
　　5.统计学方法:结果以均数士标准差(无士、)表示,应用SPSS10.0统计软件分析,采用单因素方差分析.
　　结果
　　1.黄蔑对HSC-T细胞c-fO5基因表达的影响(表1):对照组HSC-T细胞有c-fO5的基因表达,8h时为最高峰,后随培养时间延长逐渐下降.黄蔑两组HSC-T细胞c-fO5基因表达水平在8,24,48,72h4个时间点均低于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-fO5基因表达水平逐渐降低,两组间差异有统计学意义(P<0.01).
　　2.黄茂对HSC-T细胞c-jun基因表达的影响(表2):对照组HSC-T细胞有c-jun的基因表达,8h时为最高峰,后随培养时间延长逐渐下降.黄茂两组HSC-T细胞c-jun基因表达水平在8,24;48,72h4个时间点均显著低于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-dun基因表达水平逐渐降低;两组间差异有统计学意义(P<0.01).
　　讨论
　　肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生、发展中的最重要细胞;它不仅是肝脏中ECM的主要细胞来源,同时也是MMPs及其TIMPs的主要细胞来源;对HSC的调控决定了肝纤维化的转归.我们既往的研究表明中药复方861合剂对肝星状细胞ECM,MMPs,TIMPs的表达有明显的调节作用「6-7];作为其中的主要药物黄蔑作用明显[x;.本研究结果表明,加人黄茂的两组HSC-T细胞c-fO5,c-jun基因表达水平在8,24,48,72h4个时间点均明显低于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-fO5,c-jun基因表达水平逐渐降低;两组间差异有统计学意义.上述结果提示黄蔑对肝星状细胞c-fO5和c-}un基因表达有明显的下调作用.可能正是因为黄茂对HSC细胞c-fO5和c-jun基因表达的下调,进而抑制了肝星状细胞的增殖,并抑制了下游的一系列信号转导通路,最终发挥了其抗肝纤维化作用.黄蔑调控肝星状细胞c-fO5,c-jun基因表达的机制目前尚不清楚,尚有待进一步研究.
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