虫草酸和虫草素对肝星状细胞炎症及纤维化发生特性的影响

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维化时细胞外基质的主要来源，具有炎症表型和纤维化发生特性，能在内毒素((lippolysaccharide,LPS)刺激下表达炎症性细胞因子如单核细胞趋化蛋白一1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)，并在转化生长因子a I(transforming growth factor-(3 1,TGF p 1)刺激下诱导纤维化相关蛋白工型胶原和二平滑肌肌动蛋白(alpha muscle smooth actin，二一SMA)等的表。虫草酸和虫草素是抗纤维化扶正化疲方组分中冬虫夏草的主要成分。既往临床和实验研究结果显示，用冬虫夏草和虫草菌丝制剂治疗肝纤维化和肝硬化具有一定的效果[[4]但是，其抗肝纤维化的有效成分及具体机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨虫草酸和虫草素对体外HSC株炎症及纤维化生物学特性的影响，以探索冬虫夏草抗肝纤维化的组分及其作用机制。

材料与方法

一、材料

1.细胞株:永生化野生型小鼠HSC株(JS1)来源见文献.主要试剂:DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco公司;大肠杆菌内毒素0111:B4,TGF(3 1均购自美国Sigma公司;反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒均购自中国大连宝生物有限公司;TR工zol RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司;鼠抗二一SMA抗体购自美国Sigma公司;兔抗工型胶原抗体购自美国Rockland公司;兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)第一抗体，FITC标记抗兔、抗鼠第二抗体，SDS蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒均购自中国广州碧云天公司;MCP-1酶联免疫吸附检测试剂盒购自美国eBioscience公司。3.实验药物:虫草酸和虫草素均购自上海融禾生物科技有限公司，纯度均>98%。虫草酸分子式为C}H,406，分子量为182.17，虫草素分子式为}101}13N5，分子量为251.24，两者均用灭菌水配制成10 mmol/L的贮存液。TGFpI用无血清培养基配制成5 mg/L的贮存液，LPS用磷酸盐缓冲液酉己制成1 mg/ml的贮存液。

二、方法

1.虫草酸和虫草素对LPS诱导的JS1细胞MCP-1 mRNA表达的影响:将生长良好的JS1细胞用胰酶消化后，以2x 10`个/nil接种于h孔板中，24 h后加人干预试剂及药物。实验分为空白对照(NC)组、药物对照组、LPS组、LPS+药物处理组。其中NC组用磷酸盐缓冲液处理;LPS组予终浓度为100 ng/nil的LPS刺激;药物对照组予虫草酸或虫草素10}mol/L处理;LPS+药物处理组设3个虫草酸或虫草素药物浓度(10,50或200}1 mol/L)处理，同时予终浓度为100 ng/ml的LPS刺激。加人干预试剂及药物后继续置37℃、5%CO:饱和湿度孵育箱中培养12h，总RNA抽提采用美国Invitrogen公司Trizol Reagent根据说明书进行操作，RNA抽提后琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。将1,u g总RNA反转录成cDNA,以cDNA产物为模板行实时荧光定量PCR扩增。每组同时以GAPDH为内参照，反应体系及条件按照说明书进行。使用的小鼠MCP-1引物序列:正义:5‘-GCCCTAAGGTCTTCAGCACCTT-3‘，反义:5‘-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3'。甘油醛-3-磷酸脱氢酶引物序列:正义:5‘-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3'，反义:5‘-TCTCCATGGTGGTGAAGACA-3'。

2.虫草酸和虫草素对LPS诱导的JS1细胞分泌MCP-1的影响:将生长良好的JS1细胞用胰酶消化后，以2 x 105个/耐接种于6孔板中，24 h后加入干预试剂及药物，实验分组及干预同上。加人干预试剂及药物后继续置37℃、5%CO:饱和湿度孵育箱中培养，24 h后收集细胞上清液，-80℃冻存，1个月内测定分析。以酶联免疫吸附法检测HSC培养上清液MCP-1的分泌水平，具体操作按试剂盒说明进行。

3.虫草酸和虫草素对TGF a 1诱导的JS1细胞工型胶原及二一SMA表达的影响:将生长良好的JS1细胞用胰酶消化后，以2 X 105个/ml接种于10 cm的培养皿中，24 h后加人干预试剂TGF p 1及药物，实验分组及药物的作用浓度同上(诱导剂LPS换为TGF p 1),TGF(3 1的刺激终浓度为10 ng/ml。加人干预试剂及药物后继续置37℃、5%CO:饱和湿度孵育箱中培养24 h，收集细胞。加SDS裂解缓冲液，超声裂解，离心收集上清液。BCA法测定蛋白浓度，操作按试剂盒说明进行。Western blot检测各组工型胶原及a-SMA的表达情况，结果采用工mage J软件进行灰度扫描和半定量分析。

4.统计学方法:用SPSS16.0统计学软件进行，采用双侧t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.虫草酸对LPS诱导的JS1细胞MCP-1的表达和分泌的影响:与NC组(设表达和分泌量为1)相比，LPS组MCP-1的mRNA表达及蛋白分泌显著升高，LPS+虫草酸组(10,50或200}mol/L)其MCP-1 mRNA的表达及蛋白分泌与单用LPS处理组比较，均有下降，以LPS+200 a mol/L虫草酸组效果最为明显(mRNA相对表达量:2.07士0.29比3.35士0.26,t=15.90,P<0.05;蛋白相对分泌量:1.88士0.06比2.33士0.06,t=10.39 P G 0.05)，见图1，图2

2.虫草素对LPS诱导的JSl细胞MCP-1的表达和分泌的影响:类似虫草酸研究结果，LPS+虫草素组(10,50或200}u mol/L)处理细胞的MCP-1 mRNA的表达及蛋白分泌与单用LPS组比较，均有下降，其中以LPS+200}mol/L虫草素组MCP-1 mRNA及蛋白下降最为明显(mRNA相对表达量:1.15士0.23比4.17士0.61扩=8.93,P<0.05，蛋白:1.47士0.25比1.97士0.04,t=4.60,P<0.05)，见图3，图4.

3.虫草酸和虫草素对TGF p 1诱导的JS1细胞工型胶原及二一SMA表达的影响:与NC组相比，TGF口1组工型胶原及a-SMA表达量显著升高，加人不同浓度的虫草酸或虫草素处理后，其表达量较TGFpI组均下降，并均以200}u mol/L药物作用组下降最为明显(TGF a 1+200 a mol/L虫草酸组比TGF p 1组，I型胶原灰度值:0.95士0.13比1.24土0.18,t=2.52,尸<0.05;二名MA灰度值:0.81士0.13比1.05士0.14,t=2.86,P<0.05;TGF p 1+200 a mol/L虫草素组比TGF p 1组，I型胶原灰度值:0.92士0.08比1.22士0.03,t=8.09,P<0.01;a-SMA灰度值:0.81士0.01比1.00士0.12,t=3.58,P<0.01)。见图5.

讨论

样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)是细胞表面特异性识别受体，LPS是其天然外源性配体[fsl髓样分化因子88作为LPS-TLR4信号通路的关键适配器蛋白，可介导下游核因子KB及促分裂原活化蛋白激酶等信号通路的激活和炎症性细胞因子(如肿瘤坏死因子a，白细胞介素1，白细胞介素6),MCP-1、反应性氧自由基及勃附分子的产生。肝纤维化是多种因素参与的复杂过程，HSC在其发生和发展中起重要作用。除纤维化发生特性外，活化的HSC具有完整的TLR4信号途径和炎症表型。肝损伤时肝脏和循环血中升高的内、外源性TLR4配体可刺激HSC而影响其生物学特性[6]。本研究采用LPS刺激传代培养的HSC，观察虫草酸和虫草素处理对LPS诱导的TLR4信号通路下游产物(以MCP-1为代表)表达的影响，结果显示虫草酸和虫草素对LPS诱导的HSC的MCP-1的mRNA和蛋白表达增高有剂量依赖性的显著抑制作用，提示虫草酸和虫草素能抑制HSC的LPS-TLR4信号通路，降低炎症h}趁化因子的表达。TGFal是调控肝纤维化发展的核心物质[3]。

活化的HSC自分泌和旁分泌TGF(3 1，促进并维持HSC的活化，产生大量细胞因子及以胶原为主的细胞外基质。TGF p 1还可通过调节基质金属蛋白酶的产生和活性来干扰细胞外基质代谢，并能增加基质金属蛋白酶抑制剂的表达，引起细胞外基质降解减少和净沉积增加，加速肝纤维化发展。Seki等[[o发现TLR4-髓样分化因子88信号途径能通过下调TGF p 1的假受体BAMBI，从而敏感化TGFpI信号和促进肝纤维化的发生，进一步将肝脏炎症反应与纤维化发生信号密切关联起来。本研究采用TGF p 1刺激HSC纤维化发生特性，观察虫草酸和虫草素干预的效果，结果显示药物处理能显著降低TGF p 1刺激诱导的HSC的纤维化指标工型胶原及。-SMA的表达，并且随着药物浓度的增加，其抑制程度呈剂量依赖性增加，提示虫草酸和虫草素能通过抑制TGF p 1诱导的HSC的工型胶原及二一SMA的表达而抑制纤维化发生，更深人的机制有待进一步研究。

参考文献

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[3]Gressner AM,Weiskirchen R,Breitkopf K.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis[J].Frontiers in Bioscience,2002.d793-d807.

[4]李风华,刘平,熊卫国.虫草多糖逆转DMN诱导大鼠肝纤维化的作用及机制研究[J].中国中药杂志,2006,(23):1968-1971.doi:10.3321/j.issn:1001-5302.2006.23.014.

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[6]Guo J,Friedman SL.Toll-like receptor 4 signaling in liver injury and hepatic fibrogenesis[J].Fibrosis Tissue Repair,2010.21.

[7]Seki E,De Minicis S,Osterreicher CH.TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis[J].Nature Medicine,2007.1324-1332.