生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

作者：刘超侠，孔庆兖
 
【关键词】  胃癌细胞
　　摘要 :目的  探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。 方法  设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组:空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Western blot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。 结果  脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P<0.05），而各对照组间差异无显著性（P>0.05）;ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P<0.05），而各对照组间差异无显著性（P>0.05）。 结论  生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。
　　关键词 :反义寡核苷酸;生存素;胃癌细胞
　　Inhibitory effects of survivin antisense oligonucleotide on human gastric cancer cells
　　LIU Chao-xia，KONG Qing-yan
　　（Department of Pathology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）
   
　　Abstract:Objective To investigate the inhibitory effects of survivin antisense oligonucleotide（ASODN）on human gastric carcinoma cell line SGC7901.Methods ASODN targeting survivin was designed and constructed.Cultured cancer cells were divided into4groups:sham control group，lipofectin control group，oligonucleotide（SODN）control group and ASODN test group.After transfection for48h，cultured cells were harvested to proceed with the tests for:survivin protein expression by Western blot，apoptotic rate（AR）by flow cytometry，the rate of inhibition（IR）by colorimetric MTT cell viability.proliferation assay.Results The expression of survivin in SGC7901cancer cells decreased after being transfected with survivin ASODN.The AR and IR in ASODN test group were significantly higher than in the control groups.Conclusions The expression of sur-vivin may be decreased in gastric cancer cells after ASODN transfection.Survivin ASODN can induce apoptosis and inhibit pro-liferation of SGC7901cells，and hence，may well be a prospective anti-cancer drug.
   
　　Key words:antisense oligonucleotide;survivin;gastric cancer
      
　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，因其早期诊断率较低和易发生多药耐药，中、晚期胃癌的预后欠佳。近期研究显示，约80%的胃癌表达生存素（survivin）基因，且生存素的表达水平与胃癌患者的预后呈负相关［1-2］ 。基因治疗成为近年来研究的热点。进一步的研究表明，survivin反义核酸及显性负突变体能够诱导细胞自发性凋亡和明显抑制肿瘤的生长，为肿瘤基因治疗研究提供了新的靶位［3］ 。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASODN）作为一种新型药物，通过多种途径介导靶基因的降解，抑制DNA的复制、转录和转录后的加工和翻译［4］ 。我们采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸（survivin ASODN）转染人胃癌细胞SGC7901，以封闭survivin基因的表达，并观察其对胃癌细胞SGC7901凋亡的作用。
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料  胃癌细胞株SGC7901购于中国科学院细胞生物研究所。survivin反义链［5］ 、错配链（与反义寡核苷酸相同碱基组成、不同排列顺序）由上海生工生物工程公司合成，两端3个碱基经硫代修饰以对抗核酸酶的降解。反义链:5′-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3′;错配链:5′-GCC ACT CCT CGA CTC TCG TC-3′。阳离子脂质体Lipofectin购于Invitrogen公司。survivin抗体及HRP标记的第二抗体购于Santa Cruz公司。RPMI1640购于Invitrio-gen公司。小牛血清购于杭州四季青公司。

　1.2 方法
    
　　1.2.1 细胞株培养 人胃癌细胞株SGC7901用含10%小牛血清的RPMI1640培养基，在37℃含5%CO 2 的饱和湿度条件下培养。
   
　　1.2.2 细胞分组及转染 取对数生长期的SGC7901，传代接种于6孔培养板内，调整细胞浓度，使每孔的细胞数为3×10 5 ，常规条件下培养24h，显微镜下观察，约80%细胞融合时开始实验。设置空白对照组（Sham组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义链转染对照组（Lip-SODN组）和反义链转染组（Lip-ASODN组），每组设3个复孔。将脂质体分别与正、反义寡核苷酸混合，制成脂质体-寡核苷酸复合物，调节寡核苷酸终浓度为0.5μmol.L，分别作用于Lip-SODN组和Lip-ASODN组;Lip组用单纯的脂质体，用量与以上2组相同。细胞转染过程按转染试剂盒说明书进行，48h后收集各组细胞并用于后续实验。
   
　　1.2.3 Western blot法检测细胞生存素蛋白表达 将预冷至4℃的匀浆缓冲液加入到经HBSS漂洗的培养细胞中，冰上刮取细胞，收集，冰浴中超声10s×3，测定蛋白浓度，以100μg.孔上样，15%SDS2PAGE凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白质从SDS2PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜置封闭液中室温孵育3h后，加入一抗（兔抗人生存素抗体，稀释度为1∶500）4℃孵育过夜，TBST充分漂洗（5min×3次），加入AP标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG-AP，稀释度为1∶500）37℃作用2h，TBST充分漂洗（5min×3次），以NBT.BCIP显色，观察结果。
   
　　1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将收获的各组细胞制成单细胞悬液，加入预冷70%的冰乙醇，-20℃内固定24h，加RNA酶（终浓度为50mg.L）37℃反应1h，再加入碘化丙啶溶液（浓度为100mg.L）避光染色30min后，在流式细胞仪上检测，应用相应程序软件进行资料的处理和分析。
   
　　1.2.5 MTT法检测各组细胞的生长抑制率 收获的各组细胞用含10%小牛血清的RPMI1640重悬，在倒置显微镜下计数细胞，调整细胞浓度为1×10 7 .L，并接种于96孔板内，每组设置5个复孔。常规条件下培养48h，每孔加入5g.L的MTT20μl，继续培养4h，倾尽上清。每孔加入二甲基亚砜0.1ml，摇床上摇动约15min以充分溶解，用酶标仪在波长570nm处检测各孔吸光度值（A值），细胞生 长抑制率（IR）=（1-实验组平均A值）.空白对照组平均A值×100%。
   
　　1.2.6 统计学处理 采用SPSS10.0软件，应用方差分析、q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
    
　　2 结果
    
　　2.1 ASODN转染后SGC7901细胞生存素蛋白表达变化  Lip-ASODN组生存素蛋白表达下调，与各对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），而各对照组生存素蛋白表达无明显改变，各对照组间差异无统计学意义（P>0.05）（图1）。
 
　　图1  各组细胞生存素蛋白表达（略）
   
　　与其他组比较:*P<0.05
    
　　2.2 ASODN转染对细胞凋亡率的影响  ASODN转染可诱导SGC7901细胞凋亡，Lip-ASODN组细胞凋亡率明显高于各对照组（P<0.05），而各对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
    
　　表1  ASODN转染对细胞凋亡率的影响（略）

　　与各对照组比较:*P<0.05
    
　　2.3 ASODN转染对胃癌细胞增殖的影响  ASODN转染的SGC7901细胞生长抑制率明显高于各对照组（P<0.05），空白对照组、单纯脂质体对照组和正义链转染对照组间差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。 

　　表2  各组SGC7901细胞的生长抑制率（略）

与各对照组比较:*P<0.05

　　3 讨论
    
　　机体维持正常形态和功能的重要方面是机体细胞增殖和凋亡的平衡，这种平衡依赖机体正常的网络调控系统的调控，但当各种致瘤因素同时或（和）序贯的方式作用于机体时，调控机体细胞增殖和凋亡平衡的网络系统可能会发生紊乱，导致机体细胞增殖和凋亡的平衡受到破坏。细胞增殖的增加和凋亡的减少都可以是肿瘤发生的原因，在细胞凋亡的途径中的调节异常也可能导致肿瘤的发生，并且可以影响肿瘤患者的预后或导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性［5］ 。目前的研究显示，几乎所有的肿瘤都有不同程度的增殖旺盛和凋亡减少。在胃癌的发生发展过程中同样存在增殖和凋亡的失平衡，研究表明某些基因的表达与增殖和凋亡的状况有密切关系。近来发现一种新的凋亡抑制因子survivin，属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员，定位于人类染色体17q25，具有抑制细胞凋亡的作用。一般而言，经典的凋亡途径有两条，即线粒体途径和死亡受体途径。bcl-2和bcl-xl多阻断线粒体途径，而survivin是直接阻断2条凋亡途径下游的共同通路，即caspase-3和caspase-7凋亡效应蛋白的活性，所以它是一种双重阻断。
   
　　survivin在细胞中的表达具有严格的细胞周期性，在G 2 .M期特异性表达。并且survivin的表达具有高度特异性，在大多数肿瘤组织和胚胎发育组织中表达，在成人的子宫内膜组织、胎盘和胸腺组织中有不同程度的表达，而在正常成人终末分化组织中不表达［6-7］ 。大量研究表明:survivin在非小细胞肺癌、胃癌组织或细胞株中均可被检测到［8-9］ ，且其表达往往与上述肿瘤的恶性程度、预后不良呈正相关。研究表明，survivin可抑制胃癌细胞凋亡，促进胃癌细胞增殖［10-11］ 。又由于survivin在胃癌组织中表达，而在正常胃黏膜中未见表达，使得靶向survivin治疗胃癌成为可能，且能保证机体正常组织的安全性。
   
　　本实验通过将生存素反义寡核苷酸转染至胃癌细胞株内，发现它能降低survivin基因的表达、抑制细胞的生长并诱导其凋亡;采用流式细胞术对转染后SGC7901细胞的凋亡情况进行检测，亦证明ASODN转染能明显诱导凋亡，抑制增殖。这与国外研究所报道的在皮肤癌、乳腺癌细胞株中转染生存 素阴性突变质粒所诱导的细胞凋亡作用是相符的［12-13］ 。提示采用基因技术封闭生存素蛋白表达，可解除生存素对凋亡的抑制作用，诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗目的，而且由于其表达的特异性，生存素反义寡核苷酸不会诱导正常细胞凋亡，可以预测将生存素反义寡核苷酸作用于动物或人体的体内实验会有很高的安全性。

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