转化生长因子β1对A549细胞晚期糖基化终产物受体与细胞外基质表达的影响

　　晚期糖基化终产物受体(reccptorforadvancedglycationendproducts,RAGE)是细胞表面分子中免疫球蛋白超家族成员之一。RAGE与配体在细胞表面结合,参与调控细胞内信号转导,导致细胞功能紊乱,产生生物学效应。胚胎发育时,多种组织内RAGE表达丰富,而成人除肺组织以外表达较少,主要在肺内皮细胞、肺泡上皮细胞、支气管和血管平滑肌细胞及肺泡巨噬细胞表达,并主要以可溶性的形式存在[明。在肺纤维化动物模型,RAGE[5]表达降低。RAGE基因缺失型的小鼠,可自发引起胶原一I和羟脯氨酸增多等肺纤维化改变,这种基因缺失的小鼠经石棉处理后发生肺纤维化的风险明显提高[6],提示RAGE在肺纤维化形成中发挥重要作用,有可能成为治疗肺纤维化新的分子靶点。RAGE与肺纤维化的关系密切,但国内尚少关注。本实验通过转化生长因子βl刺激来源于人Ⅱ型肺泡上皮细胞的A5荃9细胞,观察A549细胞的RAGE、胶原I、旷平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达变化及其相互关系,初步探讨RAGE在肺纤维化形成中的作用。
　　1材料与方法
　　1。1试剂TGFβl购自萝乏国Pepr°tcchINC公司,RAGE及GAPDH引物由上海捷瑞生物公司合成,RAGE鼠抗人一抗购自Eptomics公司,胶原I、αSMA兔抗人一抗购自Sigma公司;GAPDH兔抗人一抗购自~slgma公司。
　　1。2实验方法
　　1.2.1细胞培养人A549细胞购自中科院上海细胞库9用含10%胎牛血清(GIBCO公司)的DMEM(GIBCO公司)培养基,细胞在37C、5%CO2、饱和湿度下培养。用0.25%胰酶(GIBCO公司)消化,按5×106个/ml接种于25cm2培养瓶中。待细胞传代后融合至90%并处于对数生长期日寸,吸弃培养液,将F12培养液和DMEM培养基以体积比1:1混合,用无血清培养细胞饥饿扭h使细胞同期同步化,以不加TGFβl(0ug/L)刺激的A549细胞为对照组;分别用2ug/L、5ug/I'、10uyL的TGFβl处理后,于12h、2蓬h、36h时间点,行下述检测。以上每组样本量为3例。
　　1.2.2RTPCR在细胞培养瓶中加人Tozol试剂(凯基公司)1ml,按其说明书操作,提取细胞总RNA。利用凯基公司逆转录试剂盒,在25ul逆转录反应体系中,以3.0gmRNA为模板逆转录为cDNA,产物cDNA于一⒛·C保存。RAGE引物:′TCTGTGGGGFFCAGTAGTA-3′;反义引物:5′TTTTCTGGGGCcTTCcTcTC3′。内参⒈GAPDH引物:5′-ACCACAGTCcATGCCATCAC-3′;反义引物:5′TCCACCACCcTGTTGcTGTA3′。PCR反应体积为25ul,主要反应条件为:95C变性60s,62℃退火30s,72C延伸60s,28个循环。R⒎PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,对该条带片段进行测序,鉴定其为所需的目的片段。电泳条带采用凝胶成像系统(Labworks公司)做积分吸亮度(IA)测定,并分别以实验组与对照组目的与内参照(GAPDH)的IA比值的变化来衡量RAGE的mRNA表达的相对变化。每组样本量为3例。
　　1.2.3Westernblotti呷收集各组细胞并裂解细胞,提取细胞蛋白质。BCA蛋白试剂盒(Pierce)测定蛋白含量,取50ug蛋白量溶液,经12%和5%SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜上;5%脱脂牛奶室温封闭1.5h;一抗孵育,4C冰箱过夜,二抗室温孵育2h,发光剂孵育(SanmCruz),显影,定影,扫描分析。利用QuantityOne软件测定实验组与对照组和内参照(βactin)的比值,来衡量各蛋白表达的相对变化情况。每组样本量为3例。
　　1.3数据统计处理RTPCR、westcrnbl°tting实验重复3次,数据用i土s表示,利用sPSS17,o统计软件进行分析,组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用g检验(Duncan法),指标之间关系采用直线相关分析,P(0.O5为差异有统计学意义,P(0,01为差异有显著统计学意义。
　　2结果
　　2.1TGFβl对A549细胞RAGEmRNA表达的影响随着TG,βI刺激细胞的时间延长,AM9细胞RAGE的mRNA表达逐步降低,呈时间-浓度依赖关系。TGFβ1(5ug/L)作用24h,与对照组(1.345±o.132)相比RAGEmRNA表达(0.387±0,088)明显降低(P(0,o1)(图1)。作用24h,5ug/LTGFβ1组(0,387±0,088)较2ug/LTGF_β1组(0.748±o,o48)RAGEmRNA表达降低更明显(P<0.o5×图2)。2.2TGFβ1对A549细胞RAGE蛋白表达的影响用Westernblotting检测RAGE蛋白表达,结果显示,A549细胞RAGE蛋白表达与TGFβ1呈时间-浓度依赖关系。5u酽LTG,β1作用24h后,A549细胞RAGE蛋白表达(0.174±0.061)较对照组(1.229±0,112)降低(P<0.01)(图3)。刺激A549细胞24h,5ug/LTGFβl组RAGE蛋白表达(0,174±0.061)与2ug/LTGFβ组(0,719±0.061)相比,RAGE蛋白表达明显降低(P<0.05×图4)。
　　2.3TG,β对A549细胞旷SMA、胶原-I蛋白表达的影响5ug/LTGFβ刺激后A549细胞,随着刺激时间的延长,在不同的时间,胶原I及αsMA蛋白表达含量逐步增多,至24h时(0.916±0.071和0.899±0,022),分别较对照组(0,295±0,041和0.134±0.028)升高约3.1和6,7倍(P(0,01)。A549细胞的旷SMA、胶原I蛋白表达与TGRβ1的浓度呈时间一浓度依赖关系(图5,6)。
　　2.4RAGE蛋白与胶原一I蛋白和旷SMA蛋白表达的相关性5ug/LTGFβ1刺激A549细胞,RAGE蛋白表达明显下降,而胶原-I蛋白和旷SMA蛋白表达明显升高。对RAGE蛋白与胶原一I蛋白和αSMA蛋白表达含量分别进行直线相关分析,RAGF蛋白表达与胶原-I蛋白(r=-o.843,P(0,05)呈负相关;与αSMA蛋白表达呈负相关(r=-0,897,P<o,05)。3讨论特发性肺纤维化(IPF)为原因不明并以普通型间质性肺炎为特征性病理改变的一种慢性纤维化性间质性肺疾病,预后不良,无有效治疗药物。目前认为,肺泡上皮细胞损伤、再上皮化异常修复、上皮细胞向间充质细胞转化(epithelialmy⒒broblasttransi0on,EMT)和成纤维细胞增殖是IPF的重要发病机制。
　　针对肺泡上皮细胞和成纤维细胞寻找新的分子靶点,是目前IPF的研究重点和热点之一。RAGE在肺内皮细胞、肺泡上皮细胞、支气管和血管平滑肌细胞及肺泡巨噬细胞表达丰富。Fehrenbach等将兔肺组织免疫组化染色,检测发现RAGE存在于肺泡I型上皮细胞的基底部,有学者提出RAGE是肺泡l型上皮细胞标志物之一,而Katsuoka等发现具有与肺泡Ⅱ型上皮细胞相似性质的A549细胞表达RAGE的mRNA和蛋白也很丰富。
　　Kasper等L1钊将兔肺组织切片经CdC12和TGFTβl处理后,发现肺泡上皮细胞的RAGE表达明显下调。研究发现IPF患者的肺泡Ⅱ型上皮细胞[6]和支气管肺泡灌洗液[1列中RAGE表达较对照组明显降低。RAGE减少可导致肺基底膜的破坏,肺泡损伤,阻止上皮细胞再生,导致肺纤维化。以上研究的结果表明,肺组织RAGE的缺乏与肺纤维化的发生发展密切相关。RAGE可能为IPF的治疗提供一个新的潜在分子靶点。本实验发现,与对照组相比,经TGFβ1刺激后,A549细胞RAGEmRNA和蛋白表达明显下降;随着TGFβ1刺激细胞的时间延长及浓度的增加,A549细胞RAGEmRNA和蛋白表达逐步降低,呈浓度-时间依赖关系,提示A549细胞在TGFβ1作用下RAGE表达明显下调。
　　成纤维细胞灶形成是IPF的重要组织病理学特征,主要由表达旷SMA的肌成纤维细胞构成,其合成胶原纤维的能力约是成纤维细胞的4~5倍,是分泌细胞外基质的主要效应细胞。局部肺纤维化区域的TGFβ1可以激活成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,诱导成纤维细胞的细胞外基质大量产生,从而促进肺纤维化形成。本实验同时观察TGFβ1刺激前后,A549细胞RAGEmRNA和蛋白、αSMA和细胞外基质的主要成分胶原I的表达变化。我们的结果显示,TGFβl下调A549细胞RAGEmRNA和蛋白表达,而明显上调犷sMA和胶原-I表达,相关分析也表明RAGE表达下调与αSMA和胶原一I的表达上调呈负相关,提示A549细胞RAGE表达下调可能影响了细胞外基质合成功能。Englert等[17]研究发现RAGE基因缺失型的小鼠,可自发引起胶原一I和羟脯氨酸增多等肺纤维化改变,这种基因缺失的小鼠经石棉处理后发生肺纤维化的风险明显提高。Queisser等[1矧观察经s汉NA敲除RAGE的A549,其增殖和迁移能力明显增强,发生EMT,分泌胶原和细胞外基质的能力明显增强。以往的报道与本实验的结果均表明:RAGE表达下调与肺纤维化的发生和发展有关。
　　现有的研究发现,RAGE下调与肺纤维化的发生和发展的机理涉及多条信号传导通路。RAGE是个多配体受体,可识别高度聚糖化作用终产物(advancedglycationendproducts,AGEs)、淀粉样蛋白阡肽、人高泳动族蛋白BI(HMGBI)、S100及甲状腺运载蛋白等配体。作为RAGE的主要配体AGEs与RAGE结合,可抑制TGFβ1所致的smad2磷酸化,阻断其与smad4的联系,阻止smad~2/3/4复合物的核移位,并提高smad7表达,中断TGFβ1/smad-2/3/4信号通路传导,抑制EMT,减少细胞外基质沉积,负性调节肺纤维化进程[l叫。也有学者发现RAGEHMGBI信号通路在博莱霉素所致的EMT中发挥作用,参与肺纤维化[划。因此,RAGE在调节肺纤维化形成和发展中的作用,分子机理及潜在治疗价值值得关注和深入研究。
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