不同浓度雾化吸入海风藤对急性肺损伤新生大鼠CC16的影响

新生儿急性肺损伤(ALI)是新生儿期的急重症及致死疾病之一,主要治疗手段为机械通气及液体管理。目前,药物治疗昂贵且效果不确切。本研究通过随机对照研究,制备新生大鼠ALI模型,予雾化吸人不同剂量及浓度海风藤提取物,观察其对反映 ALI的指标Clara细胞蛋白(Clara cell protein, CC16)表达的影响,从而提出中药海风藤能减轻内毒素(LPS)血症导致的肺血管壁高通透性肺水肿, 探讨将海风藤应用于新生儿AⅡ 治疗的可能性及效果,以期为开拓中药治疗新生儿重症疾病的新领域提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 日龄6~7d SD新生大鼠150 只(广州中医药大学实验动物中心提供),体质量 10~19g, SPF级。

1.1.2 大肠杆菌内毒素脂多糖由美国⒊gma公司提供,CC16定量检测试剂盒由Uscnli妃公司提供。海风藤购自广州医学院第二附属医院中药房。

1.1.3 海风藤提取液的制各 将海风藤干燥藤茎加工成粗粉质量21OO g,加9~s%的乙醇浸泡过夜 (粗粉与乙醇之比为⒈10),超声提取们min后过滤,药渣再加乙醇浸泡(1:7)过夜,再继续超声提取细mh,过滤,重复上述步骤2次,合并3次乙醇提取液置BUCⅢ 旋转蒸发仪(瑞士)中减压浓缩成棕色膏状物,带有明显的胡椒属芳香味,总回收率约为 30:I,最后将浸膏与二甲基亚砜(DMs0)混合,溶解,制成浓度为10%的海风藤提取液。

1.2 实验动物及分组 将150只新生SD大鼠均予LPS5m酽kg剂量腹腔注射,建立新生大鼠ALI 动物模型[12],随机分为注射LPS后未治疗组(对照组)50只、海风藤低浓度治疗组(治疗1组,10 m酽炖)50只和高浓度治疗组(治疗2组,30m酽吒) 50只。大鼠按时间点处死。各组分5个亚组,每组 10只,根据LPS注射后处死时间分为:8h组、⒛ h 组J8h组、” h组Jd组;治疗1组与治疗2组未到时间点处死的按低浓度(10m酽kg)与高浓度(30 m酽吒)予海风藤提取液雾化,雾化时间为注射LPS 厅手2h、26h、50h、74h、98 h、122h、146 h⊙ 又寸只黑绉臣及治疗组均有死亡。见表1。

1.3 标本采集及指标检测 1.3.1 肺组织标本采集、组织学检查及肺湿质量/ 干质量(W/D)测定 按分组时间采样,解剖鼠胸腔察看肺组织外观。分离左上肺在4%多聚甲醛中固定⒓ ~刎h,脱水、包蜡、切片、HE染色后,予光镜检查其病理变化。分离左下肺测湿质量,放⒛ ℃ 恒温箱⒛ h,测干质量,计肺W/D比值。

1.3.2 血清标本、支气管肺泡灌洗液(BALF)的采集及测定 血清标本:取大鼠血0.4~0.5mL,离心 10血n(15OO1·/min)后采血清,-⒛ ℃保存待测。 BALF:分离气管后用留置针头伸人气管,予4℃ 生理盐水0.2mL灌洗(共4次,0.8mL),得BALF液大约0.5mL后一SO℃ 冻存。双抗体夹心ELISA法 CC16含量测定(实验步骤操作按试剂说明书)。

1.4 统计学处理 计量资料以(死±s)表示,差异比较采用SPSS13.0统计软件进行方差分析,以P< 0,O~s为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学改变

2,1.1 鼠肺外观 肉眼观察,新生鼠肺损伤模型以肺水肿及出血为主要表现,程度有不同分级[11⒓ ], 对照及治疗1、2组均可见肺表面有不同程度的体积增大、切面肿胀、弹性降低、点状或片状出血,但LPS 注射娲h后同一时间点治疗2组均明显较对照组及治疗1组水肿程度轻、出血肺叶面积少。对照组与治疗1组无明显差异。见彩色插页图1、2。

2.1.2 光镜 肺组织切片光镜下,对照及治疗1、2 组各组均可见肺泡壁增宽,间质水肿,肺泡腔变小、部分破坏,肺泡腔和间质红细胞渗出,但LPS注射鲳h后同一时间点对照组及治疗1组均较治疗2组以上改变更明显,前者可见大量红细胞,后者为少量红细胞渗出。见彩色插页图3、4。

2.2 肺W/D比值 对照组及治疗1、2组肺Wr/D 比值均升高,zh为高峰,之后回落,7d后存活鼠 W/D比值接近正常值。治疗2组在彳h~7d亚组与对照组比较有显著差异,治疗1组与对照组除 ” h亚组P<0.Os外,其余均无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

2.3 血清及BALF CC16含量 对照组及治疗1、2 组血清CC16含量均呈先升后降的趋势,治疗2组在zh~7d亚组与对照组比较差异均有统计学意义,治疗1组与对照组除” h亚组P<0。“ 外,其余均无统计学意义。LPS致伤后各组大鼠BALF中 CC16水平均迅速下降,鲳h后逐渐回升,但程度有所不同,治疗2组在8~72h亚组与对照组比较均有极显著差异,治疗1组与对照组除48、72h亚组 P(0.Os外,其余均无统计学意义。见表1、3。

3 讨论目前,国内外对成人ALI的机制及治疗方面研究较多,因新生儿机体小,发育不完善,使新生儿急性肺损伤的治疗与成人有差异及有更多限制,用中药治疗新生儿ALI的研究及报道均很少[3]。中药是我国传统医药,海风藤价格便宜且不稀缺,肖飞等[4]用不同浓度的海风藤做研究,发现其无细胞毒性。应用中药海风藤治疗新生大鼠急性肺损伤,动态观察其对反映ALI的指标CC16的影响,目前,国内外我们尚未见有相关报道。海风藤是胡椒科植物风藤的藤茎,辛、苦,微温。性能祛湿、行气、活血、温通经脉,以消肿、去瘀、止痛,已有现代药理研究表明海风藤的提取物中有多种作用,包括抑制血小板活化因子(PAF)作用,抗炎和镇痛作用,局部缺血组织保护作用,抗氧化作用及可以拮抗内毒素引起的动脉血压下降,并能减轻内毒素血症致肺血管壁通透性增高引起的肺水肿等作用[5]。

Clara细胞是主要分布于呼吸道细支气管黏膜上的矮柱状无纤毛立方上皮细胞,具有分泌功能,其最主要的功能蛋白为CC16,CC16在气道中含量丰富,可在血清及BALF中检测,占BALF中可溶性蛋白总量的2%~3%[6]。BALF中CC16含量是分泌与清除速率之间关系的反映,CC16分泌和清除失衡时其BALF中浓度会上升或下降;CC16能被动弥散至血清,所以,血清CC16浓度和气道内其合成量紧密联系,也与肺泡上皮及血管内皮完整性相关。 ALI发生后可致αara细胞受损,在血清及BALF中的CC16含量发生改变,血清CC16被认为是提示直接或间接肺损伤的生物学标记物[7]。CC16具有抗炎、免疫抑制及抗纤维化等生物活性,其含量的多少又可影响机体的修复,遂监测CC16的变化,可以间接反映AI,I的程度及转归。

从本实验结果可见,在病理上,对照组及雾化低浓度海风藤的治疗1组均较雾化高浓度海风藤的治疗2组肺水肿及肺出血程度重;肺W/D比值方面, 也与之相符。尤其在雾化治疗后,高浓度组叨h~ 7d亚组与对照组比较差异均有统计学意义,低浓度组仅” h组差异有统计学意义(P<0.“ ),由此推出,高浓度海风藤才能达到有效地减轻肺水肿,低浓度海风藤效果较差。利用海风藤能行气宽中,温通经脉,临床已用于呼吸困难、咳喘等治疗[:]。ALI 病理生理改变以肺顺应性降低,肺内分流增加及通气/血流比例失调,微循环障碍为主。这与中医学认为的各种病因导致的血液停滞,运行不畅的 “ 血瘀证 ” 相符。有研究表明,活血去瘀,能增加肺微血管对肺水肿液的吸收,从而减轻肺水肿,所以海风藤活血去瘀的功效可改善AⅡ 的转归。我们的实验结果也可以看出,高浓度雾化海风藤在一定程度上缓解 ALI病变的发生与发展,减轻内毒素血症对肺血管壁通透性增高引起的肺水肿,促进肺水肿的吸收。从肺鼠外观可见高浓度海风藤组各亚组均较对照组肺出血的程度低及面积少,而不是出血后消散吸收快,由此推论,海风藤可能有阻止或延缓肺泡、毛细血管破裂,从而减少肺出血的作用。

在实验中,各组BALF中CC16含量水平均迅速下降,但高浓度海风藤组在8~” h亚组与对照组比较差异均有统计学意义,下降的幅度小且恢复快, 可考虑为高浓度海风藤对支气管C1ara细胞有一定的保护作用,减少Clara细胞受损,从而使CC16的分泌量虽有降低但明显高于对照组,同时,CC16的生物学特性有免疫抑制作用、抗炎作用和清除肺内有害物质的作用[9],使因高浓度海风藤组CC16含量水平较对照组高,继而肺损伤后肺部炎症反应较对照组小且炎症恢复快,表现为肺水肿及肺出血程度较对照组轻。这与王林等[IO]研究中,海风藤酮对急性胰腺炎合并肺损伤大鼠炎症介质刀r、TNF~α 和IL-6均有明显的抑制作用相符。

对照组及治疗1、2组血清CC16含量水平均呈先升后降的趋势。但高浓度海风藤组在⒛ h~7d 亚组与对照组比较差异均有统计学意义,显示为上升幅度较对照组小且回落快。这先升后降的变化与 BALF中CC16水平及肺泡上皮及血管内皮完整性的关系密不可分。肺损伤早期,αara细胞受损,支气管内CC16的分泌量减少,肺泡上皮及血管内皮完整性也遭破坏,导致虽分泌量减少,却弥散至血清内的CC16增多,也加重了支气管内CC16含量的进一步下降,之后因CC16分泌衰竭及肺泡上皮及血管内皮完整性修复,血清CC16下降。在实验中,病理可看出海风藤能减轻肺水肿,众所周知,ALI的肺水肿是肺血管壁通透性增高引起,海风藤性能祛湿、行气、活血去瘀。因此,海风藤能促进肺微血管对水肿吸收,但结合本实验中血清CC16含量的变化及高浓度海风藤组血CC16高峰较对照组明显低,认为高浓度海风藤还可能减轻ALI对血管内皮完整性的损害,从而使通透性降低使肺水肿程度减轻。

综上所述,初步认为应用海风藤治疗新生鼠 ALI有一定的效果,但需雾化浓度较高,这对机体有无毒副作用,需我们进一步研究。

参考文献

[1] Murakami K,Okajima K,Uchiba M . The prevention of lipopolysaccharide-induced pulmonary vascular injury by pretreatment with cepharanthine in rots . American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine , 2000年 161卷 第01期

[2] Wutzler S,Lehnert T,Laurer H . Circulating levels of Clara cell protein 16 but not surfactant protein D identify and quantify lung damage in patients with multiple injuries . Journal of Trauma-Injury Infection and Critical Care , 2011年 71卷 第02期

[3] 王贞佐,呼海涛,孟庆繁 . 海风藤的研究进展 . 时珍国医国药 , 2006年 17卷 第07期

[4] Tillema MS,Lorenz KL,Weiss MG . Sublethal endotoxemia promotes pulmonary cytokine-induced neutrophil chemoattractant expression and neutrophil recruitment but not over lung injury in neonatal rats . Biology of the Neonate , 2000年 78卷 第04期

[5] Van Miert E,Sardella A,Nickmilder M . Respiratory effects associated with wood fuel use:a cross-sectional biomarker study among adolescents . Pediatric Pulmonology , 2012年 47卷 第04期

[6] 宋敬丽,袁林,刘艳菊 . 海风藤化学成分和药理作用的研究进展 . 湖北中医学院学报 , 2007年 9卷 第03期

[7] 洪辉华,蔡宛如 . 急性肺损伤的发病机制及中医药治疗的实验研究进展 . 浙江中医药大学学报 , 2007年 31卷 第01期

[8] 蔡栩栩,刘春峰,韩玉昆 . 内毒素致新生和成年大鼠急性肺损伤的比较 . 中华急诊医学杂志 , 2005年 14卷 第06期

[9] 王林,姚俊,耿智敏 . 海风藤酮治疗大鼠实验性急性胰腺炎 . 第四军医大学学报 , 2006年 27卷 第13期

[10] 肖飞,李晓光,高勤 . 广东海风藤多糖对M146L细胞分泌的β淀粉样蛋白生成的抑制作用 . 中国老年学杂志 , 2009年 29卷 第19期