microRNA在肺纤维化发病机制中的作用

肺间质纤维化是由多种诱因引起的肺间质的炎症性疾病,是一种进行性、致死性的慢性疾病,是呼吸衰竭的重要病因。其中,特发性肺间质纤维化(IPF)为最常见的类型。IPF多为散发,男性多于女性,确诊后的平均生存时间是2~5年,目前世界各国的发病率均呈上升趋势,严重威胁着人类的生命健康。IPF病因不明,其发病可能与遗传、病毒感染、药物毒性、吸烟、老龄等多种因素有关。迄今为止,虽然国内外相关研究很多,也不断取得新的进展,但对于IPF的发病机制仍不明了(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA。迄今为止,已鉴定的miRNA多达上千种,调控机体约90%以上的基因表达。

miRNA与多种人类疾病紧密相关。近年来,随着mlRNA在心、肝、肾等脏器纤维化发病机制中作用的阐释,研究人员对肺纤维化发生过程中mlRNA的异常表达及功能也进行了初步探讨。

1.miRNA在肺纤维化模型鼠疾病发生中的作用20O9年,Potuer等曰率先报道了在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中miR-155的表达显著增加,且miR-155的表达水平与肺纤维化的病变程度紧密相关。体外细胞实验中,研究人员通过转染增加人肺成纤维细胞系(HFL1)内mR-155的表达,继而通过芯片检测及数据库预测对转染后细胞内差异显著的mRNA的功能进行了分析,发现其多与凋亡、迁移有关,并进一步证实高表达miR-155可使HFL1细胞的增殖、迁移活性发生改变。此外,细胞实验还发现炎性细胞因子(月中瘤坏死因子α和白介素1β)可诱导人肺成纤维细胞系中miR-155的表达,相反转化生长因子βl(TGFβl)则抑制其表达。进一步的荧光素酶实验显示miR-155可与成纤维细胞生长因子7的3′UTR相结合并调控其表达。虽然该研究未对IPF患者体内miR-155的水平进行检验,但该文献首次表明了mlRNA在肺纤维化发病机制中起着一定的作用。同年,hu等[5]对博莱霉素诱导的小鼠模型肺组织中mRNA的表达谱进行了分析,发现miR-21的表达显著增加,对IPF患者肺组织中表达水平的检测得出了相同的结论。细胞实验证实miR-21可靶向结合于抑制性信号分子SMAD家族成员7(Smad7)的3′UTR区而抑制其表达。进一步对TGFβlⅡ型受体缺陷的转基因小鼠的研究证实TGFβ1可调控miR21的表达,并发现在miR-21和TGFβ信号通路间存在正反馈调节机制,即:TGFβ上调miR21的表达,继而使其靶蛋白——Smad7的水平降低,TGFβ信号通路活化而促进疾病的演进和发展。接下来研究人员通过细胞实验对上述结论进行了验证,通过转染改变人成纤维细胞系(MRC5)内源性miR21的表达,可使细胞内纤维连接蛋白、旷平滑肌肌动蛋白的表达水平、Smad2的磷酸化水平发生相应的改变,表明miR-21参与调控TG,β的促纤维化效应。值得一提的是,该研究还在小鼠体内对miR21的潜在治疗作用进行了初步探讨:使用反义寡核苷酸抑制模型鼠体内mi艮21的表达,可使肺组织基质蛋白的表达显著降低,胶原沉积减少,肺纤维化病变程度减轻。Xie等[6]通过miRNAarray技术对博莱霉素诱导的肺纤维化模型鼠不同病理阶段肺组织miRNA的表达谱进行了分析,发现在造模后不同时间点miRNA的表达呈现出特异的变化:在造模后的早期阶段,共有58种mlRNA呈现差异表达,其中36种下调,22种上调;而后期共有40种miRNA异常表达,其中25种下调,15种上调。进一步使用数据库对差异miRNA的靶基因及其功能进行预测和分析,发现早期阶段异常表达的miRNA多与凋亡和炎症信号通路有关,而晚期差异显著的miRNA多靶向调控纤维化相关的信号通路的活性。该研究进一步为miRNA在肺纤维化疾病进程中的作用提供了重要依据。最近,文献报道[7]在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中,miR29的表达显著下降,且下降水平与纤维化病变程度反向相关。体外效应机制的研究表明,抑制人肺纤维母细胞内源性miR29的表达后,可便多种促纤维化基因的表达上调,其中大部分基因在TGRβ刺激后也可升高,对该细胞内基因组表达谱的变化进行分析,并与博莱霉素诱导的IPF鼠肺中基因组表达谱的改变进行对比,发现两者中差异表达的基因约42%相吻合,且这些基因多为mi艮29的预测靶基因,预示mR-29在博莱霉素诱导的肺纤维化模型的发病机制中起着重要作用。对经TGFβ处理的人肺纤维母细胞内miRNA表达谱进行分析,发现TGFβ对miR-29家族所有成员的表达均具有下调作用,而对该细胞内mRNA表达谱进行分析,并与抑制细胞内源性miR29的表达后基因组表达谱的改变相对比,发现两者差异表达的基因中约40%相吻合,而其中约89%为mit29的预测靶基因,表明mlR-29可能是TGFβ上调促纤维化基因表达的效应机制之一。

2.最近,Yang等又发现,模型鼠及IPF患者肺组织中miR-200的表达均显著降低。分离培养鼠原代肺上皮细胞及成纤维细胞,对细胞内miRL200的表达水平分别进行检测,发现miR_~900主要表达于肺上皮细胞中。在肺上皮细胞系(RI'E6TN)中的实验发现,TGFβ可下调miR-200的表达,而高表达miR2oO可抑制TGFβ的促纤维化效应,使肺成纤维细胞标志物分子的表达显著降低,上皮细胞标志物的表达增加,反之亦然。通过转染增加原代培养的模型鼠及IPF患者肺成纤维细胞中内源性mi艮200的表达,可使其纤维连接蛋白、旷平滑肌肌动蛋白的表达水平显著降低,表明miR2o0可抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。进一步小鼠体内实验显示,经气管内给予人工合成的miR2o0类似物升高模型鼠体内miR2o0的表达,可减轻肺组织间质的生成及胶原沉积,从而延缓肺纤维化病变的进展。2012年最新报道[9]:博莱霉素诱导的模型鼠肺内、分离培养的IPF患者、模型鼠肺成纤维细胞内miR31的表达均显著降低。进一步的细胞实验发现miR31可靶向作用于大鼠同源家族成员蛋白A(Rashom°logfami1ymemberA,RhoA)和整联蛋白α5(ITGAV)的3′UTR区,下调其表达(已知这两种蛋白为肺纤维化相关致病因子,其在模型鼠肺内的表达均显著增加)。体外功能分析发现,miR31可抑制人肺成纤维细胞的纤维生成、收缩、纤维黏附、迁移活性。同样,使用RNA干扰技术抑制该细胞内RhoA和ITGAV的表达可获得同样的结果,表明miR-31是通过下调RhoA和ITGAV的表达来实现其对成纤维细胞的调控作用。此外,研究人员还通过小鼠体内实验证实:经过气管内给药增加小鼠肺内miR31的表达可抑制肺肌成纤维细胞的分化,减少胶原蛋白的沉积,延缓肺纤维化的发生,预示着miR31有望成为肺纤维化的一个新的治疗靶点。2临床IPF患者肺组织中miRNA的异常表达及作用2010年,Pandit等[10]通过芯片对IPF患者肺中450种miRNA的表达谱进行了分析,结果发现与正常人相比,IPF患者肺中约10%的miRNA发生了异常改变。进一步对显著降低的let7d进行分析,发现let7d表达降低可使其具有促进肺上皮细胞间充质转分化功能的靶基因——高迁移率家族成员2的表达水平显著增加。通过染色质免疫共沉淀及电泳迁移率分析发现,TGΓβ可通过促进Smad3与let7d启动子区相结合而抑制其表达,表明下调let-7d表达为TGFβ发挥促纤维化作用的下游效应机制之一。此外,细胞实验还表明使用反义寡核苷酸抑制肺上皮细胞系内源性let7d的表达,可使其间质细胞特异性标志物的表达显著增加,上皮细胞特异性标志分子的表达显著降低。同样,抑制小鼠体内1e17d的表达,可使肺组织中上述标志物分子发生类似的改变,同时使肺泡间隔增宽、胶原沉积增加,表明let7d的异常表达与肺纤维化的发生紧密相关。原位杂交实验证实在正常肺组织中let7d主要定位表达于肺泡上皮细胞,且let7d阳性上皮细胞数与肺功能指标——用力肺活量正相关。表明一定水平的let7d表达为正常肺功能所必需。IPF是一种进行性发展的疾病,然而,在疾病的演进及发展过程中有高度的个体差异性,有的患者在确诊后数月至1年内病情即迅速加重及恶化,而有的患者病情可在数年内保持稳定。近期,Oak等111]对快速进展型与相对稳定型IPF患者肺组织中miRNA的表达谱进行了分析,结果发现与正常对照组相比,进展型患者肺中11种miRNA的表达显著增加,36种miRNA的表达显著降低,而稳定型患者肺中仅有4种增加。将两者的表达谱进行对比分析,发现进展型患者肺组织中miR3o2c、miR—42⒊5p、miR210、miR376c、miR-185的表达显著增加。进一步的研究表明与稳定型IPF相比,进展型患者肺中RNA沉默诱导复合物的主要成分Argonaute蛋白1和A鸠onaute蛋白2的表达显著降低,表明miRNA的加工异常可能是导致IPF快速进展的因素之一。上述对人和鼠的研究初步表明,miRNA参与肺纤维化疾病的发生与发展,并可能在其中起着重要的调控作用。此外,这些报道还提示纠正差异miRNA的表达具有潜在的治疗价值,即miRNA有望为临床治疗提供新的靶点。

3.研究现状分析

近年来,尽管有关miRNA在肺间质纤维化发病机制中作用的探索取得了一定进展,然而相关方面的研究尚处于起步阶段,大量工作和问题仍有待开展和探讨。Pandit等使用数据库对经芯片筛选出的、IPF患者肺中差异表达的miRNA的预测靶基因的功能进行了汇总分析,结果显示(图1)这些靶分子多与TGFβ1、Wnt、p53、血管内皮生长因子等信号通路有关,而这些信号通路均在疾病的发生中起着重要的作用。进一步将这些靶分子与IPF患者肺组织的mRNA表达谱进行对比分析,结果显示,基因表达谱中的差异mRNA多为异常表达的miRNA的靶分子,表明miRNA在IPF的发病机制中起着重要的调控作用。此外,通过图1还可发现,一种miRNA可同时调控多个、位于不同信号通路中的靶分子的表达,从而调控多条信号通路的活性。而反过来,一个靶分子的表达又同时受多种miRNA所调控。如:IPF患者肺中异常高表达的IGF1同时接受mR-29、let7、miR-30、miR338的协同调控,而芯片检测结果则显示这四种miRNA的表达均显著降低,说明miRNA调控紊乱在IP中广泛存在。值得一提的是,虽然该图对疾病中miRNA的复杂调控网络进行了总体描绘,然而,图中所示仅为芯片分析和数据库预测结果,其中miRNA的表达及对靶mRNA的调控作用均需进一步的验证。对肺间质纤维化疾病状态下miRNA的研究还发现在miRNA及其表达调控因素之间存在反馈作用机制,即参与疾病发生的信号通路的活化是导致miRNA异常表达的因素之一,而反过来miRNA的差异表达又可影响该信号通路中相关活性分子的水平,使通路活化而导致疾病的演进和发展。如let7d、miR21均可通过反馈环扩大TGFβl信号通路的效应。据此,我们可以推测在miR29和TGFβ1、miR155和TGFβ1之间也可能有类似的效应机制存在(已知TGFβ1可降低miR29水平[7],增加miR-155表达[d]),但该假设尚需进一步的实验验证。此外,今后在选择治疗靶点时需考虑这种复杂的相互作用机制的存在,并借助生物信息学方法鉴定最佳的干预点。

4展望

肺间质纤维化是一种多因素参与的复杂性疾病,迄今为止,对于其确切的发病机制仍不明了。miRNA在人体多种生理病理过程中的调控作用已得到证实,详细阐述miRNA在肺纤维化疾病发生过程中的调控网络,有望为发病机制提供重要线索。然而,既往的研究仅涉及到一小部分miRNA,今后尚需进一步对疾病发生过程中差异表达的miRNA进行广泛的鉴定及功能分析,以便为最佳干预点的选择提供依据。因发病机制不明确,目前对于肺间质纤维化尚无特异有效的药物,主要治疗手段还是依靠传统的激素和免疫抑制剂,大多数药物的治疗机制也多仅局限在抗炎和抗氧自由基方面。虽然出现了许多新药物,如:吡非尼酮(抗纤维化药物)、细胞因子治疗、氨基酸激酶抑制剂、抗凝剂等,但疗效均不确切,且多数仍处于临床试验阶段。肺移植因存在较多不利因素也限制了开展。IPF疾病发生过程错综复杂,涉及多条信号通路活性的改变。因此,要抑制病变的发展,需对促纤维化微环境进行系统调整,单一调控某个基因、某种蛋白的表达或某一信号通路可能难以显效。而一种miRNA可同时调控多个信号通路的活性,有望达到预期效果。因此,今后尚需通过动物实验对IPF中差异表达的miRNA的潜在治疗效应进行验证,从而筛选出一组最有效的、可用于临床治疗的miRNA分子。据专家估计,miRNA有望成为IPF未来最有希望的治疗手段[12]。