小型动物肺脏灌流固定装置的研制和应用

呼吸系统疾病(如慢性阻塞性肺疾病、肺血管疾病、肺癌等)是危害人类健康的重大疾病,呼吸疾病的动物模型已广泛用于疾病的发病机制及新药开发的研究,其中实验动物的病理学资料是判断模型是否成功及科学研究的重要指标。实验动物肺脏的标准化病理处理是影响病理结果准确性的重要因素。肺脏具有体积顺应性,在吸气和呼气时体积相差较大,理想的固定方法按吸气时肺的容积自然固定,这样有助于保持肺组织的自然形态。但目前尚无可以对实验动物肺部实现有效标准化病理固定的装置。我们研制的这种装置制作简单,操作方便,成本低,可规范化控制,为实验动物肺组织的标准化固定提供了可靠、稳定的实验器具。

1小动物肺脏灌流固定装置的结构与工作原理

1.1小动物肺脏灌注固定装置的结构和组成该装置由用于放置动物肺脏的工作台、用于盛放固定液的灌流容器、灌流管、用于固定灌流容器的固定夹及标有刻度的支撑杆组成。固定夹包括固定端和夹持端,固定端具有形状与支撑杆横截面形状相适配的通孔,套接在支撑杆上,可通过滑动调节固定夹的高度,并通过螺丝进行固定。夹持端夹持固定灌流容器,固定灌流容器则垂直于工作台的水平面。灌流容器为一直径1.5~50px圆柱体,下端通过三通阀与灌流管连接,上端开口不密封与空气连通。灌流容器125px侧壁处设有固定液输人口,与可定量向灌流容器内注人固定液的注射器连接。并可将该注射器设计为由自动化控制装置控制,以实现定时、定量将固定液加入灌流容器中,使每次的灌流液压相同,保证了实验的均一性。结构示意图见图1。

1.2小动物肺脏灌注固定装置工作原理将实验动物麻醉后分离气管,取出动物气管、肺脏,将动物肺脏放置于工作台上,并位于灌流容器的正下方。向灌流容器中加人固定液,打开三通阀,排出灌流管中的空气。再根据动物种类及肺脏大小,向灌流容器内加人相应体积的固定液,这样灌流容器内的固定液液面与动物肺脏之间形成一定的高度差,并可通过固定夹位置的移动调节液压的大小,灌流管一端插人动物肺脏气管内并结扎固定,打开阀门,固定液在重力的作用下流人动物肺脏,即可完成肺组织灌流固定。

2常用实验动物的肺脏灌流固定

2.1大鼠肺脏的灌注固定SPF级雄性Sprague~Daw1ey(SD)大鼠,体质量180~200g,共6只,由广东省实验动物中心提供ESCXK(粤)⒛080002彐。随机分为灌注固定组和常规直接固定对照组,每组各3只。将大鼠称重后,根据体质量给予相应剂量的麻醉剂进行麻醉,将麻醉好的大鼠固定,剪开颈部皮肤,分离气管,完整取出气管及大鼠肺脏。将分离出的气管及肺脏放置于肺脏灌流固定装置的工作台上,排出灌流管内空气后,加人2ml4%多聚甲醛溶液,调节固定夹位置,使固定液液面距大鼠肺平面的高度为500px。将灌流管下端插入气管内,并结扎固定,打开灌流容器下阀门,利用静液压,固定液自然流入大鼠肺内,待固定液全部流人肺内,使肺脏呈自然扩张的状态后,取下气管,再灌注⒛~30min后将肺脏置人4%多聚甲醛溶液进行固定⒛h,制各石蜡切片,HE染色后显微镜下观察肺组织形态。并与常规直接固定法进行比较。

2.2小鼠肺脏的灌注固定SPF级雄性昆明小鼠,体质量18~20g,共6只,由广东省实验动物中心提供ESCXK(粤)⒛080002]。随机分为灌注固定组和常规直接固定对照组,每组各3只。将小鼠称重后,根据体质量给予相应剂量的麻醉剂进行麻醉,将麻醉好的小鼠固定,剪开颈部皮肤,分离气管,完整取出气管及肺脏。将分离出的气管及肺脏放置于肺脏灌流固定装置的工作台上,排出灌流管内空气后,加人0.6m14%多聚甲醛溶液,调节固定夹位置,使固定液液面距实验动物肺平面的高度为500px。将灌流管下端插入气管内,并结扎固定,打开灌流容器下阀门,利用静液压,固定液自然流人小鼠肺内,待固定液全部流人肺内,使肺脏呈自然扩张的状态后,取下气管,再灌注15~⒛min后将肺脏置入4%多聚甲醛溶液进行固定24h,制备石蜡切片,HE染色后显微镜下观察肺组织形态。并与常规直接固定法进行比较。

3结果

3.1小动物肺脏灌注固定装置灌注效果该装置可以方便、快速地对大鼠及小鼠肺脏进行均匀灌注,并可根据动物的体质量调整灌注固定液的体积。灌注的动力为固定液的静液压,并可控制灌流容器的高度,保证实验的均一性,实现标准化灌注固定。以大鼠肺脏灌注为例,整个灌注过程在2s内完成,肺脏各个肺叶均得到充分均匀灌注,灌注后的肺脏呈自然的充盈状态,肺尖部也得到充分灌注固定(图2),保持肺脏原有组织结构。

3.2大鼠灌注固定肺脏HE切片与常规直接固定法比较采用本灌注固定法(图3A、B)的大鼠肺组织经HE染色后,组织结构完整清晰,肺泡腔结构清楚,肺末梢的小动脉、小静脉结构清晰,可见单层内皮细胞和平滑肌细胞层;采用现有的普通方法固定肺组织(图3C、D)经HE染色后,肺末梢结构较清楚,肺泡较萎缩,肺泡腔不干净,小血管染色后,结构不清楚,很难分辨内皮和平滑肌层。灌注固定效果明显优于普通固定方法。

3.3小鼠灌注固定肺脏HE切片与常规直接固定法比较采用本灌注固定法(图4A、B)的小鼠肺组织经HE染色后,组织结构完整清晰,肺泡腔结构清楚,肺末梢的小动脉、小静脉结构清晰,可见单层内皮细胞和平滑肌细胞层;采用现有的普通方法固定肺组织(图4C、D)经HE染色后,肺末梢结构较清楚,肺泡萎缩,肺泡腔不干净,小血管染色后,结构不清楚,很难分辨内皮和平滑肌层。灌注固定效果明显优于普通固定方法。

4讨论

目前实验动物肺脏的病理固定方法多采用福尔马林或4%多聚甲醛直接对离体动物肺脏进行浸泡固定[l],这种固定方法使肺体积急剧萎缩,压迫了肺泡、肺血管及小气管管腔,影响末梢支气管和血管病理变化的准确判断。另外还有研究者用注射器将固定液经气管注射到动物肺内进行灌注固定[2J,但这种方法常常因为施加压力过大,会破坏动物肺原有的组织形态,或因为肺脏不均匀充盈,影响实验结果。有研究者采用固定压力灌注法进行肺脏固定[刖。肺脏具有较大的体积顺应性,呼吸时体积变化较大,另外肺体积与动物体质量也有关系,理想的固定方法按吸气时肺的容积自然固定,这样有助于保存肺组织的自然形态。本研究研发的小动物肺脏灌流固定装置,可以实现大鼠、小鼠等常用实验动物的标准化灌注固定,并可根据动物体质量及肺容积调整固定液的体积,根据动物气管大小选择适当口径的灌流管,使整个操作过程方便、快速。本装置可以调整灌流容器的高度,使固定液液面与工作台上的动物肺脏之间的高度差所产生的静液压既能满足固定液经气管输送至整个动物肺脏,达到固定肺脏组织的目的,又能维持气管的结构完整性,不会因压力过大造成气管的破裂,导致实验的失败。大鼠及小鼠肺脏推荐采用500pxH2O压力或14,7mmHg压力,即1.96kPa的压力5]。正常大鼠及小鼠正常吸气末肺压力约为20~575pxH2()LbTJ,但因离体肺脏无胸腔负压的作用,因此采用⒛cmH2O静液压。

固定液体积约为吸气末肺容积。灌注时动物肺脏置于水平平台上是为了保证准确的高度差,使静液压足够充分灌注至整个肺脏,另外也和动物正常体位相符。灌流容器侧壁连通的定量注人固定液的注射器可改由自动化控制装置控制,以实现定时、定量将固定液加人灌流容器中,使每次的灌流液压相同,保证了实验的均一性。本装置可实现根据实验动物肺脏的容积进行自然固定,最大限度地保持肺组织的自然形态,可观察肺脏末端病理结构变化,可清晰观察肺泡及肺末梢气管和血管形态,明显优于常规浸泡固定法。避免了常规病理固定方法压迫了肺泡和血管管腔,影响末梢支气管和血管形态的弊端,且本方法方便易行,重复性好,成本低,固定快速,可规范化控制,便于标准化操作。可用于各种实验动物包括大鼠、小鼠等的肺脏的病理固定,为实验动物肺组织的标准化固定提供了一种可靠、稳定的实验装置,并已获得国家专利授权,专利号:ZI'2011⒛33狃12.0。本装置应用方便,调节灵活,结构简单,性能稳定,适合大规模工业化生产,进行推广使用。(本文图3~4见封三)