PCR定量检测肺炎支原体在肺炎支原体肺炎中的应用分析

肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，MP)是一种最常见的病原体，易侵入小儿体内导致呼吸道受到感染[1]。肺炎支原体临床表现多样，以各种呼吸道器官炎性反应最为多见，如咽炎、肺炎等[2]。此外，肺炎支原体还会导致呼吸器官外的全身各脏器受损，对儿童身体的危害性极大。近年婴幼儿感染率达25% ～69%，并且感染率还有逐年上升的趋势[3]。目前检测MP的方法并不唯一。以前临床诊断MP感染一般采用血清学方法，但检测结果易受多方面因素的影响，如患者的身体状况、病情的严重程度等，使得早期诊断MP感染的难度增加[4]。随着分子生物学技术的发展，近年来实时PCR法广泛应用于肺炎支原体的检测中。该法不受患者自身病情的影响，能快速、精准的检测到肺炎支原体的存在。本文对PCR定量检测法和其他检测法进行了对比，旨在探讨该法在临床诊断中的应用价值。现报告如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料：选取186例于2012年11月～2013年7月在我院接受治疗的肺炎患者。其中男111例，女75例。年龄范围为3个月～17岁，平均(5±4.3)岁。纳入标准：①持续剧烈咳嗽;②全身症状比胸部体征明显;③X射线所见较体征显著，胸片可见片状阴影的出现，肺门阴影增浓;④白细胞数量正常或稍微偏高，血沉多增快;⑤用大环内酯类药治疗病情迅速缓解。⑥均有肺炎症状和(或)体征，经一般抗生素及抗病毒药物治疗无效。排除标准：①有呼吸系统疾的患者;②患心脏病者;③有精神系统疾患病史及家族史的患者。

1.2　诊断方法：所有患者均于住院当天无菌采集咽试子标本，分别用MP快速培养法和实时PCR进行检测。MP快速培养：将咽拭子置于培养基瓶内搅动数次后，取出咽拭子，密封瓶盖，置于37℃孵箱中培养24h后观察结果。实时PCR检测：向咽拭子中加入1ml无菌生理盐水混匀。然后高速离心10min，舍去上清向离心管内加入120μl的DNA浓缩液混匀。再接着高速离心10min，弃上清向离心管内加入25μlDNA提取液。然后100℃恒温处理10min，高速离心5min，取3ul进行PCR反应测定。

1.3　观察指标：记录并比较两组检测方法下的灵敏度及特异性等相关数据。

1.4　统计学方法：所有数据均由SASS13.0统计分析软件分析。组间数据采用t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　不同性别的MP阳性检测结果：MP快速培养法检出的阳性结果为107例，其中男67例，感染率为58.6%(67/111)，女42例，感染率为56.0%(42/75);实时PCR检测出的阳性患者为104例，其中男63例，感染率为56.8%(63/111)，女41例，感染率为54.7%(41/75)。这两组数据表明无论用哪种方法检测，男性与女性的MP感染率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2　快速培养法检测MP结果和临床诊断结果比较：见表2，快速培养法对肺炎支原体肺炎诊断的灵敏度、特异度分别为81.8%(90/110)、77.6%(59/76)，阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)分别为84.1%(90/107)和74.7%(59/79)，假阳性率、假阴性率分别为22.4%(17/76)、18.2%(20/110)，诊断符合率为80.1%(149/186)。

表1　不同性别的MP阳性检测结果[例(%)]

组别              阳性数量        男性         女性

MP快速培养法      107           65(58.6)     42(56.0)

实时PCR检测法     104           63(56.8)     41(54.7)

2.3　实时PCR法检测MP结果和临床诊断结果比较：见表2，实时PCR法检测MP对肺炎支原体肺炎诊断的灵敏度、特异度分别为84.5% (93/110)、85.5%(65/76)，PPV、NPV分别为89.4%(93/104)和79.3%(65/82)，假阳性率、假阴性率分别为14.5%(11/76)、15.5%(17/110)，诊断符合率为84.9%(158/186)，见表2。

表2　快速培养法检测MP结果和临床诊断结果比较(例)

MP快速培养法           肺炎支原体肺炎        非肺炎支原体肺炎

肺炎支原体肺炎             90                     17

非肺炎支原体肺炎           20                    59

表3　实时PCR法检测MP结果和临床诊断结果比较(例)

实时PCR检测法      肺炎支原体肺炎     非肺炎支原体肺炎

肺炎支原体肺炎          93                  11

非肺炎支原体肺炎        17                  65

2.4　实时PCR法检测与快速培养法检测MP的比较：将表2、3的数据进行统计学分析，结果发现两种方法的灵敏度、阳性预测值、阴性预测值、假阴性率和诊断符合率的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的特异度为85.5% (65/76)，明显高于快速培养法的77.6%(59/76)，假阳性率为14.5%(11/76)，明显低于快速培养法的22.4%(17/76)，差异有统计学意义(P<0.05)。

3　讨论　　

近年来，导致儿童出现肺炎的主要病原体即为MP，其临床症状不典型，易导致误诊、漏诊，故早期诊断、及时治疗非常重要[5]。流行病学资料显示，MP感染主要通过呼吸道飞沫传播，易感人群是4～20岁，婴幼儿也可发病[6]。该病原体的发病年龄和易感年龄并不一致，调查发现，学龄前儿童和学龄儿童最易发病[7]。本研究不同性别的MP阳性检测结果表明，虽然肺炎支原体肺炎的发病年龄集中在龄前儿童和学龄儿童期，但其发病与性别无关，男女的发病率比较差异无统计学意义(P>0.05)。新生儿MP发病初期缺乏特异的临床特征，多以上呼吸道感染开始，肺部X线表现多样，以肺纹理增多为主。痰、鼻和咽拭子培养可获肺炎支原体，临床上一般采用该方法进行诊断[8]。但是支原体在培养基上生长速度缓慢，达到能检测到的标准用时较长，难以满足早期诊断要求。随着分子生物学技术在支原体研究领域的应用，PCR技术已经成为较快检测支原体感染的方法。实时PCR整个操作只要数个小时，且可减少假阳性的干扰，亦可了解MP在患儿体内的复制情况[9]。　　

快速培养法是近年发展起来的一种直接检测MP病原体的实验室方法，具有简便，快速，敏感的优点。因为这种培养液里面添加了高营养成分和快速生长因子，即使加入极少量的支原体也可以在短时间内快速增殖，一天内即可得到结果。所以该方法在发病初期也能检测得到MP[10]。本研究结果显示，快速培养法与实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的灵敏度、阳性预测值、假阴性率及诊断符合率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。快速培养法虽然比一般的培养时间大大缩短，但是其与实时PCR法相比特异性较低、出现假阳性的比例较大。本研究结果显示，快速培养法的特异性为77.6%(59/76)，假阳性比例为22.4%(17/76)，与实时PCR的85.5%(65/76)和14.5%(11/76)相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。分析出现这两点差异的可能原因为：①可能与快速培养法使用的培养液有关，标本中的真菌也能在培养液中生长引起假阳性;②快速培养法只有在MP存活的情况下才能够检出，而PCR法并不依赖这一点。　　

综上所述，实时PCR可快速、准确的检测到患者体内的MP，值得在临床上推广应用，为肺炎支原体肺炎的早期诊断、治疗提供重要的依据。然而该方法也存在不足之处，尽管PCR技术不断改善，但仅靠这一种方法诊断MP感染是不够的，并且该方法易受标本来源和试剂特异性的影响。如能将多方法结合用于MP感染的早期检测，不但有利于疾病的诊断，而且可以有效地避免漏检，提高检测的准确性，为临床医生提供快速可靠的检验依据。　

4  参考文献

[1]　周喜友，肖克林，袁康凯.实时PCR和颗粒凝集法检测 儿童呼吸道肺炎支原体感染[J].临床和实验医学杂志，2013，12(9)：701.

[2]　吴衍恒，刘洪波，师舞阳，等.Real-timePCR技术在呼吸道病毒检测中的应用与分析[J].公共卫生与预防医学，2013，12(1)：96.

[3]　徐　俊，缪美华，张学兰，等.苏州地区人博卡病毒在儿童急性呼吸道感染中的流行特征[J].分子诊断与治疗杂志，2012，4(5)：314.

[4]　林耀堂，陈海荧.三种肺炎支原体特异性抗体IgM检测方法结果的比较[J].吉林医学，2013，34(16)：3144.

[5]　张团结，孙　征.三种肺炎支原体检测方法特点比较[J].山东医药，2011，51(47)：26.

[6]　陈　沁，裘敏燕，付永锋，等.4种呼吸道病毒悬液芯片检测方法的建立[J].中国病原生物学杂志，2013，12(2)：97，130.

[7]　文惯宇，李　丹，赵德育，等.12438例呼吸道感染住院患儿MP荧光定量PCR检测结果分析[J].江苏医药，2012，38(21)：2587.

[8]　巫素婷.三种方法检测儿童肺炎支原体的比较分析[J].广西医学，2012，34(7)：933.

[9]　杜忠祥.肺炎支原体IgM、CRP联合检测在支原体肺炎中的应用探讨[J].吉林医学，2012，33(3)：484.

[10]　苑　鑫.肺炎支原体感染检测技术的研究进展[J].军事医学，2012，36(4)：316.

[收稿日期：2013-08-05　编校：李晓飞]