不同外邪对小鼠呼吸道合胞病毒含量影响的实验研究

RT-PCR是将RNA自勺反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术,该技术灵敏度高而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,它一般用于mRNA的定性分析,但如果将阳性参照基因作为内参照与待测mRNA在一个容器中进行扩增,可以对mRNA进行相对定量分析。本实验通过RT-PCR技术检测模拟的不同外界气候条件下正常及免疫低下小鼠气管肺组织中呼吸道合胞病毒(RSV)的相对含量,并应用统计学方法加以分析比较,试图寻找不同外界气候环境、小鼠免疫力、病毒含量三者之间的关系,进一步验证小鼠的健康状况不仅与所处的异常气候环境有关,还与小鼠自身的免疫状态有关,是综合因素共同作用的结果。

材料和方法

—、实验材料

1.实验动物:昆明种小鼠48只,体重(20±2)g,雌雄各半(购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,动物合格证号:SCXK-(军)2OO7-004)。

2.仪器与试剂:人工气候箱(LRH-800-GSI型,韶关市泰宏医疗器械有限公司);JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);Hcracus低温冷冻离心机(德国产);PCR仪(eppelldof);△-izol和RT-PCR试剂盒(由TransGenBiotech提供);随机引物;引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司设计);琼脂糖凝胶电泳用德国产UⅤP(紫外透射仪)凝胶成像系统扫描,电泳条带用Photoshop7.0读取均值。

二、实验方法

1.分组:小鼠适应性饲养3d后,将48只小鼠随机分为8组:正常组、风寒(模拟外感风寒)组、寒湿(模拟外感寒湿)组、湿热(模拟外感湿热)组、低免(免疫低下)组、低免风寒(免疫低下加外感风寒)组、低免寒湿(免疫低下加外感寒湿)组、低免湿热(免疫低下加外感湿热)组,每组6只。

2.造模:低免组、低免风寒组、低免寒湿组、低免湿热组小鼠每日上午10~11点腹腔注射环磷酰胺80mg·kg-1·d1,连续3d[1]。用人工气候箱制各风寒、寒湿、湿热三种环境气候[2-4]。除正常组与低免组外各组小鼠置于相应环境的人工气候箱,正常组与低免组室温正常饲养,持续7d。具体方法:风寒组与低免风寒组:风(6m·s-1)每隔1min吹1.5min,RH(空气中实际含量占同等温度下饱和含水量的百分比值)=(50±4)%,T(温度)=(6±2)℃;寒湿组与低免寒湿组:RH=(90±4)%,T=(6±2)℃;湿热组与低免湿热组:RH=(90±4)%,T=(33±2)℃;以上均每天以相应模拟气候条件刺激8h,其余时间为正常组温湿度。正常组与低免组:RH=(5O±4)%,T=(21±2)℃,每天持续24h[3,5]。

3.指标检测:处死小鼠,无菌条件下取气管和肺组织,于液氮中冻存待测。实验前先从液氮中取出冻存的气管肺组织,窒温放置30min。用RT-PCR两步法测定小鼠气管肺组织中呼吸道合胞病毒含量,由山西医科大学实验中心检测。

具体方法:按照Trizol试剂盒说明提取总RNA后,用RT-PCR试剂逆转录合成cDNA第一链,参照RT-PCR试剂盒说明进行逆转录反应,再进行PCR扩增,扩增条件:94℃20min,58℃20min,72℃20mh共32个循环。

RSV:cDNA PCR产物为197bp。上游引物序列(5′-3′):TGAACGGGAAGCTCACTGG,下游引物序列(5′-3′):TCCACCACCCTGTTGCTGTA;GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氧酶):cDNAPCR产物为307bp,上游引物序列(5′-3′):TGAACGGGAAGCT-CACTGG, 下游引物序列(5′-3′):TCCACCACCCT-G叨GCTGGA,

经过PCR反应后,取扩增产物10uL,1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,凝胶系统成像。Photoshop7.0图像识别分析系统进行电泳条带光密度扫描,RT_PCR产物比值=靶mRNA灰度自/内对照GAPDHmRNA灰度值)×100%,以上结果重复3次,取平均值[6]。

三、统计学处理

各组所得数据均以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS11.5软件统计处理,先行方差分析,组间比较采用g检验和两因素两水平的析因设计方差分析。

结果

1.不同外邪对非免疫低下小鼠气管肺组织中RSV含量的影响:与正常组比较,低免组与各外邪组(风寒组、寒湿组、湿热组)小鼠气管肺组织中RSV含量均显著升高(P<0.01)。与低免组和风寒组比较,寒湿组和湿热组RSV含量均显著升高(P<0.∞,P<0.01)。风寒组与低免组RSV含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

2.不同外邪对免疫低下小鼠气管肺组织中RSV含量的影响:与正常组比较,低免组与免疫低下和各外邪共同作用组小鼠气管肺组织中RSV含量均显著升高(P<0.01)。与低免组比较,免疫低下和各外邪共同作用组RSV含量均显著升高(P<0.Os,P<0,01)。免疫低下和各外邪共同作用组之间RSV含量差异无统计学意义(P>0.Os)。结果见表2。

3.不同外邪与免疫低下对小鼠气管肺组织中RSV含量影响的交互作用:低免组、风寒组小鼠气管肺组织中RSV含量均显著升高(P<0.01),免疫低下与外感风寒共同作用对小鼠气管肺组织中RSV含量有交互作用(P<0.05)。结果见表3~表5。

由表4~表5可见,免疫低下组与外感寒湿和湿热组小鼠气管肺组织中RSV含量均显著升高(P<0.01),但免疫低下与外感寒湿及免疫低下与外感湿热分别共同作用对小鼠气管肺组织中RSV含量无交互作用(P>0.O5)。

讨论

呼吸道合胞病毒(RSV)是有包膜的负链RNA病毒,属副粘病毒科肺炎病毒属,是呼吸道常见病毒之一。人工气候箱是具有光照、加湿等功能的高精度冷热恒温设各,它采用先进的微电脑可编程控制方式,可根据实验需要分时段设定气候箱的多项参数(温度、湿度、光照度等)来模拟自然气候,为实验提供一个理想的稳定气候环境。本研究采用人工气候箱模拟风寒、寒湿、湿热三种不同的外界气候环境,通过RT-PCR技术检测小鼠气管肺组织中RSV的含量,研究小鼠不同免疫状态和受外邪作用后的RSV含量的变化情况,探查小鼠病毒含量与免疫状态和外界气候环境之间的关系。中医理论认为不同的外界气候对不同的体质会产生不同的作用。本研究基于生态医学思想的基本理念[7],结合中医学的“六淫致病论”,根据西医学对细菌和病毒等生物学的认识,认为人于天地之间,是自然界的产物,禀天地之气生,依四时之法成。细菌和病毒作为自然界的一个生物种群,与自然和人体架构着一个从整体生态到分子生态的生态系统,其对人体的致病性,并不仅仅只取决于细菌或病毒本身,而是由这一生态系统的相互作用状态决定的[8]。疾病的产生是与气候的反常、正气的强弱以及致病因子等多种因素共同作用,是宿主、病毒、环境之间的相关性失衡所致,是“生态病因所为”。

现代研究[9]发现,人体最适宜的环境气温为15~”℃、相对湿度30%~ω%。气流、气温、湿度的变化均可使机体免疫力受到影响。气流达到0.5m·s1时开始影响人体体温调节和主观感觉,超过6m·sl的持续强烈的气流可以引起神经、精神过度紧张,甚至导致心血管病的发作。异常的温度变化会使免疫力降低而致病。有学者[10]人工建立外感风寒证小鼠模型,观察到风寒刺激后小鼠的网状内皮系统廊清功能及腹腔巨噬细胞释放过氧化氢量受到明显抑制,同时风寒两气致病的作用机制与抑制机体非特异性细胞免疫功能有关。进一步验证了寒冷环境会降低机体的免疫功能。裴国献[11]发现如果气温超过刀℃时,机体开始出现中枢神经系统功能低下,免疫力下降,皮肤血管舒张等反应。在碉℃时免疫细胞即可受到抑制,d~s℃时则可发生不可逆性损伤。湿环境同样会影响人体的正常生理活动,也与机体的免疫功能有关。如果相对湿度过高,达到80%以上,会使人出现一系列病理表现。张六通和梅家俊[12]通过实验建立外湿模型研究发现外湿、寒湿、湿热大鼠双歧杆菌数明显减少,屏障作用减弱,引起需氧或兼性厌氧菌增加,导致某些肠道致病菌在肠黏膜上繁殖而引起腹泻。研究还发现湿邪致病可引起细胞免疫功能的降低,使外湿证大鼠免疫系统功能紊乱,白细胞介素-2(IL-2)活性降低。严灿和高敏[闸]观察到湿阻证患者T淋巴细胞亚群、IL-2受体、红细细胞免疫功能、尿木糖排泄率等指标变化。

佟丽等[14]建立湿热症模型观察到大鼠红细胞免疫异常。都说明了湿环境对人体的免疫力有抑制作用。本研究结果显示:在非免疫低下状态下感受风寒、寒湿、湿热外邪后小鼠气管肺组织中均含有不同量的RSV。风寒组与免疫低下组RSV含量无显著性差异,而寒湿、湿热组RSV含量较免疫低下、风寒组显著增加。反映出湿热、寒湿环境对小鼠的致病能力最强,风寒和免疫力低下次之。《素问·评热病论》曰:“邪之所凑,其气必虚。”说明正常的气候环境对小鼠的免疫力影响不大,不同的异常气候环境对小鼠的健康会有不同的影响。本研究认为,湿热、寒湿之邪较风寒之邪对正常小鼠影响显著,从中是否可以得出湿邪是使病毒含量增加的主要原因,其确切性及其机理还需要进一步深入研究。在小鼠免疫力低下状态下感受风寒、寒湿、湿热外邪后,小鼠气管肺组织中RSV含量均较正常组和免疫低下组显著升高。但免疫力低下状态下感受风寒、寒湿、湿热外邪之间RSV含量无显著性差异。说明在免疫力低下状态时,任一外邪均可使机体RSV含量增加而发病。研究结果还显示,在免疫低下状态下感受外感风寒较非免疫低下感受外感风寒RSV含量显著增加,说明正气的状态决定着外邪致病力的强弱。“风雨寒热,不得虚,邪不能独伤人。卒然逢疾风暴雨而不病者,盖无虚,故邪不能独伤人。此必因虚,邪之风,与其身形两虚相得,乃客其形。”(《灵枢·百病始生》)表明了小鼠的健康与否,不仅取决于环境的影响,与自身的免疫力(即正气充足与否)也密切相关。免疫力强则不易患病,对外界的恶劣环境也有较强的适应能力,若免疫力弱,正气不足,抗邪能力弱,则更易受外界的恶劣环境的侵袭而致病,患病的程度也更为严重。在免疫低下状态下感受外感寒湿和湿热之邪较非免疫低下感受同一邪气无显著变化,可能是由于寒湿和湿热之邪致病力较强,而对免疫力低下与否对机体均有较强的影响。可见外邪的过强,对非免疫低下和免疫低下小鼠的致病性无显著性差异。说明正气虚,邪气偏盛可发病。而正气不虚,邪气绝对偏盛亦可致病。总之,气管肺组织中的RSV含量与外部环境相关。在免疫正常条件下,寒湿、湿热影响更为显著。在免疫低下条件下,任一外邪对RSV含量均有明显影响,说明小鼠健康状态与自身免疫状态、外邪的种类、强弱及RSV含量相关。其发病与否是多种因素共同作用的结果。其相互之间关系变化对机体的影响尚需进一步研究。可见,自然界的变化与人体的生理病理息息相关,人体通过自身适应自然界的调节能力与大自然和谐共处。但是当自然界的运动变化达到了一定的限度,超过了人体对外界环境的适应能力,或是人体适应外界的能力下降,则两者之间的平衡就会被打破,导致疾病的发生。