铜绿假单胞菌耐药相关基因研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA) 是引起临床各种感染特别是医院内感染的主要致病菌之一,极易产生耐药性,在临床分离的革兰阴性菌中所占比率位居第二。PA耐药机制复杂,目前已知PA的耐药机制有灭活酶的产生、生物膜的形成、细胞膜的低通透性、主动外排系统、药物作用靶位的改变等[1]。本文从基因层面阐述PA相关耐药机制。

 1 膜孔蛋白编码基因0prD2的缺失或突变

以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素药物必须通过细菌外膜才能到达作用靶位,而外膜蛋白 OprD2是亚胺培南进人细菌的特异性通道,在抗生素的选择压力和长时间使用下可加快细菌突变的速度,PA更易丢失外膜蛋白,导致多药耐药[2]。已有较多文献报道PA对亚胺培南耐药主要与OprD2 缺失或突变有关。耐药株0prD2基因变异可以是多点突变,不同部位碱基的缺失、移码突变,也可以是大片段的碱基置换,我国大部分地区检测出PA的OprD2存在较高的缺失率,国内沈继录等研究 141株碳青霉烯类抗生素耐药PA中,有96.5% (136/141)的菌株发生OprD2编码基因的缺失或插入,导致0prD2蛋白缺失或减少[3],其结果与大多数研究者报道一致。但在颜英俊等所检测OprD2 基因缺失率仅占2.9%(l/34),提示该地区OprD2 基因缺失不是其研究中耐亚胺培南PA耐药的主要原因,虽不排除因OprD2基因突变或基因表达下调导致PA对亚胺培南耐药[4],同时也提示我们,PA是否存在其他耐药机制,有待进一步研究。

2 β-内酰胺类相关耐药基因

据2010年Bush和Jacoby更新的β内酰胺酶分类[5]显示β内酰胺酶主要包括超广谱β-内酰胺酶(extended spectram β-lactamases,ESBLs)、金属β 内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs)、AmpCβ 内酰胺酶(简称AmpC酶)和其他的酶类。

 2.1 ESBLs相关编码基因 1992年Mugnier等第一个报道的在PA上发现的ESBLs编码基因TEM-42[6]以来,现已检出的ESBLs编码基因有:TEM 型、SHV型、OXA型、VEB型、GES型、CARB型、 PER型、CTX型、LCR型、BEL型等,我国陆续在浙江、四川、上海、湖北、湖南等地检出PA的ESBLs编码基因TEM型、SHV型、OXA型、VEB型、GES 型、CARB型。其中以TEM型、OXA型研究较多。 TEM(质粒编码丝氨酸蛋白酶)是革兰阴性菌中最常见的一种广谱β-内酰胺酶,目前已发现了160种 TEM型衍生酶,该酶呈酸性,等电点为5.2~6,5, 其中大部分是ESBLs。另一种常见的编码基因 OXA型(苯唑西林酶)主要介导耐羧基组和脲基组青霉素,如替卡西林、哌拉西林、阿洛西林等。近年来已发现由OXA210突变衍生的酶,包括 OXA211、 OXA214、 OXA216、 OXA217 及 由OXA-10突变衍生的酶,包括OXA-11、OXA-14、 OXA-16、OXA-17,衍生酶水解广谱头孢菌素的能力较母酶明显提高。茅利明等近年在浙江地区检出OXA-10型阳性率46.7%,同时含有OXA-10基因的PA菌株整合酶基因阳性率为71.4%,考虑 OXA-10基因很有可能伴随整合子、质粒等可移动性遗传元件在细菌间传播,导致细菌多药耐药[7]。邹义春等在检测PA的β-内酰胺类耐药基因时检测出OXA-21-1ike基因,与美国核酸库已登录的OXA 氨基酸序列相比与0XA21型最为接近,但仍存在 2个氨基酸序列差别,为国内首次报道。

2.2 MBLs相关编码基因 因MBLs必须依赖金属离子才能发挥催化作用,所以称此类为MBLs,其活性可被离子螯合物EDTA、菲咯啉以及巯基化合物所抑制,但不被克拉维酸、舒巴坦等常见的←内酰胺酶抑制剂抑制。迄今为止发现的PA菌产MBLs 主要有:IMP、VIM、SPM、GIM、NDM、IND、Bc Ⅱ、 CcrA等,其中以VIM为主。VIM已发现27种亚型[刚(VIM1~VIM-27),大部分均含有266个氨基酸残基,其中VIM-2、VIM-4和VIM-7这3种亚型的晶体结构已经分别由Garcia-Sacz MI、Lassaux、 Borm通过Ⅺ射线衍射所得[8-10]。目前正致力于从巯基化合物及其衍生物等方面研究VIM型MBLs 的抑制剂,若成功之后将会对临床治疗带来福音。在我国,所检出的PA产金属酶存在地域的差别,广东地区张颖等所检出的金属酶就以IMP型为主[11]。

2.3 Ampc酶相关编码基因 Ampc酶是一种头孢菌素酶,属Bush1群,它们在分子结构上具有同源性,按Amblel分子结构分类为C类,其优先选择的底物为头孢菌素类,与ESBLs不同的是其对头霉素类抗菌药物表现为高水平耐药,并且不被克拉维酸所抑制,但可被氯唑西林抑制。AmpC酶有染色体介导和质粒介导2种,20世纪80年代末首次分离出质粒介导的AmpC酶以来,新的质粒介导的AmpC酶在世界各地被陆续报道,如MIR、ACT、 DHA、CMY、FOX、MOX型质粒AmpC酶等。国内检测出的PA产生的AmpC酶以DHA型为主。 2011年刘立坤、李永乾研究发现在抗生素的诱导和选择性压力之下,AmpC酶菌株阳性率由实验开始的20.0%(8/40)增长到90.0%(36/40),应证了在不合理应用β-内酰胺类抗生素尤其是临床上广泛应用的第三代头孢菌素以及β内酰胺类联合酶抑制剂抗生素和碳青霉烯类抗生素的状态下,极有可能使产 AmpC酶菌株在临床上广泛传播,使PA的耐药性更加突出。 3 氨基糖苷类药物相关耐药基因细菌对氨基糖苷类药物耐药主要通过产氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside modifying enzyme, AME)、16S rRNA甲基化酶、药物作用靶位核糖体小亚单位突变、细菌外排泵增强等机制所致。但在革兰阴性杆菌中以产氨基糖苷类修饰酶和 16S rRNA甲基化酶为常见。16S rRNA甲基化酶使药物作用靶位甲基化,导致甲基化后与氨基糖苷类药物亲和力下降而耐氨基糖苷类药物。氨基糖苷类修饰酶是基团转移酶,这些酶共价修饰氨基糖苷类药物导致其结构变化,从而丧失与靶位结合的能力,导致耐药。目前已知的16S rRNA甲基化酶主要包括rmtA型、rmtB型、rmtc型、rmtD型、armA 型[12-15],在国内已检测出的rmtA型、armA型、 rmtB型。汪宏良等对所测出的rmtB基因测序,测得序列经比对与美国核酸库(GenBank)已登录的 rmtB序列均不同,存在氨基酸序列差异,因此均可以确认为新亚型[16]。暂无报道国内有PA菌检出rmtC,rmtD型。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)和核苷转移酶(ANT)三类,分别修饰氨基糖苷药物相应位置上的-OH和-NH2,降低或丧失其对靶位核糖体的亲和力。目前从美国GenBank库中已经能够检测到 AMEs有30多个基因型,我国目前检测出的基因型有aac(3)-Ⅱ、aac(6′ )- I 、aac(6′)-Ⅱ 、ant(2″)-I 和 ant(3″)-I,且不同地区的检测率均不一样,总体以 aac(3)-Ⅱ 检出率较高,aac(3)-I,ant(4′)-I,aph(3′)-Ⅱ 等暂未有报道检出。

4 氟喹诺酮类药物相关耐药基因

细菌耐喹诺酮类药物往往为细菌染色体上 gyrA、gyrB、parC、parE基因突变所致。革兰阴性菌主要为gyrA基因突变。国内外鲜有关于耐药 PA菌检出相关基因的报道,2003年宋世平等研究得出其耐喹诺酮的PA均存在gyrA基因突变,提示gyrA基因突变是PA耐喹诺酮类药物的重要原因, 但可能并非惟一原因,其文中所检测的3株中介菌株中的2株、20 株敏感菌株的1株也存在gyrA基因突变,揭示PA耐喹诺酮类药物的机制非常复杂,gyrA基因单位点突变可能仅表现为对喹诺酮类药物的低水平耐药甚至不表现出耐药,当单位点突变演变为多位点突变或合并膜通透性改变等机制时, 则产生高水平耐药。高超等研究发现耐喹诺酮的 PA的外排泵MexAB-OprM中的OprM基因及喹诺酮作用靶位DNA螺旋酶亚基gyrA的编码基因mRNA表达量不同程度上调,提示PA对喹诺酮的耐药与外排泵有很大程度的关系,同时检测gyrA 点突变位点Thr-83→Ilc[17]。近来文怡等在大肠杆菌中检测出喹诺酮耐药株gyrA基因新亚型[18],但在PA菌中未见相关报道。

仅基因突变难以解释革兰阴性菌对氟喹诺酮类抗菌药耐药逐渐上升的耐药速度。由此,质粒介导的喹诺酮类耐药现象首先在1998年1株对环丙沙星耐药的的肺炎克雷伯菌中被发现,介导耐药的基因被命名为qnr(后被命名为qnrA1)[19]。其后研究中发现了更多的qnr基因,如qnrB,qnrS,在每一种 qnr家族中还有多个亚型[20]。qnr等质粒介导的耐药基因可导致细菌对喹诺酮类的敏感性下降,2010 年王明华等在奇异变形杆菌中发现了新的质粒介导喹诺酮耐药基因qnrC。目前尚无关于PA中qnr基因报道。

5 细菌接合性质粒、转座子、整合子

细菌的接合性质粒、转座子、整合子是可移动遗传元件,使之在同种细菌菌株之间甚至不同种细菌菌株之间传递,从而使其所携带的耐药基因快速传播[21]。自Stokes等于1989年提出整合子的概念[22]解释了细菌耐药快速发展的原因,目前研究较多且得到公认的整合子主要有I,Ⅱ ,Ⅲ 和Ⅳ类整合子,其中I,Ⅱ 和Ⅱ类整合子与细菌耐药关系比较密切,常被合称为耐药整合子。在PA中,检出率最高的为I类整合子,国内已有较多报道证实其与PA耐药有很大的相关性。整合子自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上使整合子发生移动,使耐药基因发生播散。近来李小燕等对耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPa)中整合子及其携带耐药基因常的特点鉴定并分析,发现74株菌中有16株菌 (21,6%)携带整合酶基因,且均为I类整合子,同时发现7种整合子耐药基因盒的组合形式,其中有4种为首次发现:aac(6)-Ⅱ unknown-CatB3、aac(6)-Ⅱ-CatB3-ORF Ⅱ-ORF Ⅲ、b1aIMP9-aacA4-OXA—10aadA2-1ike、aac(6′)Ⅱ-blaP1baadA2[23]。在耐亚胺培南的PA菌中,仅2株菌的I类整合子中携带的IMP9与亚胺培南的耐药有关,与李杰等报道 PA耐药与金属酶关系很大的研究结果不相符[24]。余广超等在对PA菌中I类整合子携带的耐药基因中检测出新的MBLs:IMP25,该整合子可变区同时携带多种耐药基因盒,证明I类整合子参与PA 对抗生素的耐药性和多重耐药性[25]。廖如燕等为国内首次在PA菌中检出Ⅲ类整合子,得到 bkMAP耐药基因盒[26]。

转座子是指能将自身所携带的基因序列插人到基因组中任何一个在序列上与己无关的某一位点 DNA序列,分为复合转座子和Tn3转座子。在细菌中发现的最简单的一类转座子为插人序列 (insertion sequcnces,IS),转座子极易在同类生物中横向传递。目前国内关于PA转座子的报道较少。焦梅等对多药耐药铜绿假单胞菌(MDR PAE) 转座子遗传标记(tnsA/Tn7、tnpA/Tn21、ISCR1、 ISCR3/14、IS1133、IS26、ISpa7、ISkpa6、ISkpn7)进行检测,共检出了tnpA/Tn21、IS26、ISpa7这3种标记,与章清等所检出的遗传标记有相同之处,且二人的研究中同时携带大于4种可移动遗传元件的 MDR PAE菌株均为60%,从一定程度上证实 MDR PA为多耐药的表型与携带多种可移动遗传元件相关[27-28]。

接合性质粒包括traA、traF、trbC基因,分别编码细菌性毛蛋白,是细菌接合的必各部件,均为接合性质粒遗传标记。trbC基因属于宽宿主性接合性质粒遗传标记。目前在国内关于PA接合性质粒的报道较少,仅章清等国内首次在MDR PA中检出 trbC基因[28]。

综上所述,PA耐药机制极为复杂,对抗菌药物的耐药不是由单一因素造成,且不同抗生素耐药机制也有所不同,往往是几种耐药机制共同作用,使其对许多抗生素产生耐药。PA耐药性防治还需进一步研究,如寻找外膜主动外排系统的抑制剂,有效克服AmpC酶、ESBLs、MBLs,去除生物被膜的途径并应用于临床等,提高对多重耐药PA感染的疗效。

参 考 文 献

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(收稿日期:2012-05-18)