无泵驱动体外膜肺转流治疗急性呼吸衰竭犬过程中血浆和肺组织ET

　　作者：闫炀,耿希刚　　作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院心脏外科，陕西西安

　　【关键词】 急性呼吸衰竭;,内皮素

　　摘要：目的 观察双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺(bAVECMO)治疗急性呼吸衰竭(ARF)犬过程中血浆和肺组织肿瘤坏死因子α(TNFα)和内皮素1(ET1)的变化。方法 10只犬在建立ARF模型情况下给予bAVECMO治疗。分别于实验各时段提取肺组织及血浆，应用放射免疫技术检测TNFα、ET1的变化。结果 模型动物血浆ET1含量先降低，1h后开始回升，2h达到高值;肺组织匀浆ET1含量增加在转流2h达到高值。方差分析表明匀浆和血浆各自ET1的均数在转流前后有显著性差异(P<0.05)。肺组织匀浆和血浆TNFα含量转流3h后均较术前有所增高，但都呈现出先降低后升高的趋势。方差分析表明匀浆和血浆中各自TNFα的均数在转流前后有显著性差异(P<0.05)。结论 bAVECMO早期转流可能减少ET1的释放;而TNFα在转流早期对于ET1释放影响不大。

　　关键词：急性呼吸衰竭; 内皮素1;肿瘤坏死因子α; 无泵驱动体外膜肺

　　Changes of ET1 and TNFα in dog ARF model during bilateral　femoral arteriovenous shunt for extracorporeal membrane oxygenation

　　Yan Yang, Geng Xigang

　　(Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the changes of endothelin1(ET1) and tumor necrosis factor alpha(TNFα) in lung homogenate and plasm when acute respiratory failure (ARF) animal models are treated by bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation(bAVECMO). Methods Ten ARF dog models were treated by the bAVECMO. Right atrium blood and lung tissues were collected at different time points, and ET1 and TNFα were assayed by radioimmunological method. Results ET1 content in plasm decreased at first, and at 1h it was elevated and at 2h reached the peak. ET1 content in lung homogenate reached the peak at 2h and then started to decrease. The analysis of variance showed notable differences(P<0.05). TNFα content in lung homogenate and plasm decreased at 1h and started to increase after that time; it was higher at 3h than that at the beginning of operation and increased continuously. The analysis of variance showed notable differences (P<0.05). Conclusion Early bAVECMO can possibly reduce the release of ET1, while TNFα has no obvious effect on ET1 release during bAVECMO.

　　KEY WORDS: acute respiratory failure(ARF); endothelin1(ET1); tumor necrosis factor alpha(TNFα); extracorporeal membrane oxygenation

　　对急性呼吸衰竭(acute respiratory failure, ARF)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)有效治疗技术的探索是全球性的研究课题。研究发现，ARF、ARDS时肺组织和血浆中TNFα、ET1明显升高，说明其参与了急性肺损伤的病理生理过程。在治疗ARF、ARDS时，无泵驱动体外膜肺辅助转流技术(arteryvenous extracorporeal membrane oxygenation, AVECMO)应用于临床治疗重症ARDS获得成功[1]。该技术将动脉血引流出体外进行氧合再通过静脉系统进入机体，理论上对血液有形成份破坏轻，但其有效性研究未见深层报道。且在实际应用中，国外均采用单侧股动脉股静脉ECMO转流，在临床上表现了一定的不足，如引流量不够大，影响了AVECMO的效果;但如应用大口径动脉插管来增加动脉引流，则会严重影响插管侧下肢血液供应等。本项研究对原有AVECMO加以改进，首次采用双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺(bAVECMO)转流技术，治疗犬急性呼吸衰竭模型，了解转流过程中肺组织匀浆和血浆TNFα、ET1的变化，为临床应用提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物的准备 选择健康成年家犬10只，雌雄不限，体重18-35kg，平均(23.4±4.7)kg，应用35g/L的苯巴比妥100mg/kg进行腹腔注射行全身麻醉，待犬意识不清时，行气管插管与麻醉机连接。常规消毒铺巾，分别解剖犬左、右两侧的股动脉及股静脉。静脉注射肝素，用量为1mg/kg体重。股动脉、股静脉上下两端分别套丝线，结扎下端的股动脉、股静脉。阻断股动脉、股静脉上端，在阻断与结扎血管的中下端，切开血管。根据动、静脉内径的大小选择不同型号的PVC动、静脉插管，插管后结扎固定以防止脱出。常规缝合皮下、皮肤，防止伤口处渗血。将动、静脉插管与bAVECMO装置连接。右侧胸部开胸沿着第4肋间进胸，切开心包分别将心包固定在切口边缘，主动脉根部置入测压针管及测压装置，将此装置与飞利浦有创血压、心率动态监护仪连接。当bAVECMO转流时，通过bAVECMO端口应用100%氧气，其用量为(1.2±0.4)L/min。

　　1.2 标本采集 建立体外循环后，根据不同的开放途径转流收集标本。首先，在体外循环开始前，胸部切口取右肺下叶少许组织(10mm×10mm)，置液氮罐。经右心房抽血10mL于注射器内，带针头密封待检测。第二，制作动物呼吸衰竭模型进行试验。应用潘克罗宁(Pancuronrum，剂量为0.1-0.2mg/kg体重)，20kg左右的犬首次剂量为4mg，以后每30min左右追加2mg使呼吸完全消失。通过麻醉机调节呼吸频率和潮气量(一只体重在16.4-30.5kg犬在安静状态下潮气量多在251-432mL)。采用血气分析仪测定犬动脉血pH、动脉血氧分压、动脉血氧饱和度及动脉血二氧化碳分压(PaCO2)值，当达到呼吸衰竭指标时，经胸部切口取右肺下叶少许组织(10mm×10mm)，置液氮罐。右心房抽血10mL于注射器内，带针头立即密封，置冰盒后待检测。开始bAVECMO转流实验后1、2、3、4h，分别经右心房抽血10mL，胸部切口取右肺下叶少许组织(10mm×10mm)，置液氮罐待检测。

　　1.3 实验方法 血浆和肺组织内皮素的测定：采集血样以肝素作抗凝剂，分离出血浆;另制备肺组织匀浆，均置于-20℃冰箱储存待测。内皮素1、肿瘤坏死因子α放射免疫试剂盒由中国人民解放军总医院科技开发中心放免所提供，严格按说明书操作。北京核仪器厂生产的FT630G微机多探头γ计数仪计数，并给出样品浓度。

　　1.4 统计学处理 实验数据以±s表示，组内分析采用SPSS for Window10.0统计软件进行oneway ANOVA分析。

　　2 结果

　　血浆ET1含量在模型完成时先降低，1h后开始回升，2h达到高值，之后缓慢下降;肺组织匀浆ET1含量转流2h达到高值，之后缓慢下降(表1)。方差分析表明匀浆和血浆各自ET1的均数在转流前后有显著性差异(P<0.05)。肺组织匀浆ET1转流3h与4h已无显著性差别。肺组织匀浆和血浆TNFα含量转流3h后均较术前有所增高，但都呈现出先降低后升高的趋势。方差分析表明匀浆和血浆各自TNFα的均数在转流前后有显著性差异(P<0.05)。

　　表1 ET1、TNFα在转流期间的变化(略)

　　Table 1 Changes of ET1 and TNFα during bilateral femoral arteriovenous shunt for extracorporeal membrane oxygenation

　　*P>0.05 vs. 4h endothelin1 content in lung homogenate; ▲P<0.05 vs. preoperation, 1h, 2h, respectively

　　3 讨论

　　在ARF、ARDS治疗技术中，传统的ECMO方法有诸多缺点，例如可导致血液有形成分破坏、血浆蛋白变性、补体激活和消耗、激发机体的细胞和体液免疫功能、促使TNFα等细胞因子的产生。而TNFα作为一个胞内信号能诱导血管内皮细胞凋亡，促进ET1的产生而加重血管壁的损伤。为降低ECMO引起的损伤，一种无泵驱动的体外膜肺支持疗法bAVECMO，采用动静脉压力梯度驱动正逐渐应用于临床。bAVECMO避免了传统ECMO及pECMO治疗方法的诸多缺点，通过建立急性呼吸衰竭的动物模型，观察使用bAVECMO治疗期间血浆和肺组织TNFα、ET1的表达变化，对其进一步应用于临床具有重要意义。本实验采用放射免疫法测定bAVECMO早期治疗时血浆和肺组织匀浆TNFα、ET1水平的变化，结果发现,急性呼吸衰竭模型完成时，由于缺氧、PaO2下降，反射性引起交感神经兴奋，致使血浆中儿茶酚胺的水平升高,肺小动脉收缩引起肺动脉高压,内皮细胞损伤而导致TNFα、ET1水平明显升高。在给予bAVECMO转流后，由于在bAVECMO转流早期液体预充，致使转流开始时患者体内的总液体量增加，体重增加，组织水肿，血浆ET1、TNFα值相对降低。而另一方面，肺是ET1的主要生物合成和代谢场所，且急性呼吸衰竭模型建立后重新分配至肺的血流减少，故肺组织内ET1含量反而有所增加。在随后的转流中我们发现血浆ET1值在1h后开始回升，2h达到高值，之后缓慢下降;肺组织匀浆ET1含量转流2h达到高值，之后缓慢下降。由此考虑造模完成时由于肺血管内皮细胞通过一定方式感受低氧信号而使ET1的基因转录和表达发生应急反应[2]，如通过缺氧诱导因子1(HIF1)与肺血管内皮细胞中作为目标基因的ET1基因结合位点结合，启动ET1mRNA的转录与翻译[3],最终合成并持续性分泌ET1。但随bAVECMO的早期转流可能减少了ET1的进一步表达，故在早期转流致缺氧等情况改善条件下，ET1释放减少。对肺组织匀浆和血浆的TNFα的研究观察到TNFα含量转流3h后均较术前有所增高，转流4h仍有继续增高的趋势，未达到峰值。究其原因可认为bAVECMO虽消除了血泵因素对血液成分破坏所造成的TNFα的增加，但血液与管道、膜肺相接触以及气血的界面的形成仍在一定程度上引起血液细胞的变化，引发了各种细胞因子包括TNFα在内复杂的相互激活反应，促使了TNFα的释放。据此，我们认为在造模完成时，ET1已有释放，但bAVECMO的早期转流可能减少ET1的进一步表达。这与我们放免试验的结果相一致。而TNFα在bAVECMO早期有释放且可能仍有继续释放趋势，未达峰值。提示TNFα在转流早期对于ET1释放影响不大，且随TNFα释放仍有进一步升高的趋势。

　　参考文献：

　　[1]Ichiba S, Bartlett RH. Current status of extracorporeal membrane oxygenation for severe respiratory failure [J]. Artif Organs, 1996, 20(2):120123.

　　[2]Agani FH, Pichiule P, Chavez JC, et al. The role of mitochondria in the regulation of hypoxia inducible factor 1 expression during hypoxia [J]. J Biol Chem, 2000, 275(3):3586335867.

　　[3]Hu J, Discher DJ, Bishopric NH, et al. Hypoxia regulates expression of the endothelin1 gene through aproximal hypoxia in ducible factor 1 binding site on the antisense strand [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 245(2):894899.