山东汉族人群IL12B基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性

　　作者：尹迎秋,王爱华,孔令敏,张民,马道新,于　　作者单位：1. 山东大学齐鲁医院呼吸内科， 济南; 2. 山东中医药大学第二附属医院职业病科, 济南; 3. 山东省胸科医院内五科， 济南 ; 4. 山东大学齐鲁医院血液病研究室， 济南

　　【摘要】 目的 探讨白细胞介素12B(IL12B)基因1188A/C位点多态性与山东汉族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性的关系。方法 采用PCRRFLP法对324例COPD患者和389例健康人IL12B基因1188A/C位点多态性进行分型，对等位基因及基因型分布进行统计学分析。结果 IL12B基因1188A/C多态位点AA、AC、CC基因型频率在病例组中分别为0.333?3、0.478?4和0.188?3，在对照组中分别为0.357?3、0.475?6和0.167?1，A和C等位基因型的频率在病例组中分别为0.572?5和0.427?5，在对照组分别为0.595?1和0.404?9，该位点基因型和等位基因型分布在病例组与对照组P值分别为0.689，0.389，差异均无统计学意义。结论 IL12B基因1188A/C位点多态性与山东汉族人群COPD发生无明显相关性。

　　【关键词】 白细胞介素12;肺疾病，慢性阻塞性;疾病遗传易感性

　　YIN Yingqiu1, WANG Aihua1, KONG Lingmin2, ZHANG Min3, MA Daoxin4, YU Qinfeng1

　　(1. Department of Respiratory, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Department of Occupation Diseases,

　　Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250001, China;

　　3. Fifth Department of Medicine, Shandong Provincial Chest Hospital, Jinan 250013, China;

　　4. Department of Hematology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To explore the relationship between single nuclear polymorphism (SNP) of 1188A/C in the interleukin 12B gene and susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in the Chinese Han population from Shandong Province. Methods SNP 1188A/C of the IL12B gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) based on the restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique in 324 COPD subjects and 389 healthy controls. Results The frequencies of genotypes AA, AC, and CC at polymorphism sites 1188A/C were 0.333?3, 0.478?4, and 0.188?3 respectively in the COPD group, while they were 0.357?3, 0.475?6, and 0.167?1 in the control group. Also, the A type allele frequencies were 0.572?5 and 0.595?1 in patients and controls, and the C type allele frequency was 0.427?5 and 0.404?9 in COPD patients and healthy controls. There were no significant differences in genotype frequencies (P value=0.689) or allele frequencies between the two groups (P=0.389). Conclusion No significant association was found between IL12B 1188A/C polymorphism and COPD susceptibility in the Chinese Han population from Shandong Province.

　　Key words： Interleukin12; Pulmonary disease, chronic obstructive; Genetic predisposition to disease

　　慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是一个慢性炎症过程,炎症累及到自中枢气道至肺泡的所有肺组织,从而出现COPD的临床症状和病理生理改变。因此，参与肺部炎症调节的细胞因子在COPD发病过程中起着重要的作用。COPD患者外周血，支气管肺泡灌洗液中IFNγ明显升高[1]，IFNγ可促进IL12的产生,两者之间可通过正反馈途径,在调节Th亚群分化上具有协同作用。因此，IL12B对COPD的发生发展可能起着重要的作用，为分析IL12B基因在汉族人群COPD发生中的作用，本研究利用病例对照关联分析方法对324例COPD患者和389例健康对照者IL12B基因多态性和C0PD易感性之间的关系进行初步分析。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 2006年10月至2008年3月间山东大学齐鲁医院及山东中医药大学第二附属医院门诊或住院确诊的汉族COPD患者324例作为COPD组，COPD诊断符合中华医学会呼吸病学分会2007年制订的慢性阻塞性肺疾病诊断标准[2];同期健康体检者389例作为对照组。所有受试对象均排除支气管扩张、肺结核、肺部肿块、肺间质纤维化、胸部手术呼吸系统病史及心脏病等其他疾病史, 经过详细的病史调查和体格检查, 并进行胸部X片和肺功能测定。两组对象临床资料，见表1。n男女年龄(岁)有无FEV1占预计值FEV1/FVCCOPD组3241981262556954.75±20.8755.77±13.03对照组38923515460.42±8.643058499.64±15.9681.20±7.28

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 基因组DNA的提取 两组受试者经过知情同意原则后抽取外周静脉血2?mL,用EDTA抗凝。采用标准盐法从白细胞提取基因组DNA，TE液溶解，定量后-20?℃保存。

　　1.2.2 PCR检测 按照Genebank中提供的基因组序列(NC000005.8)自行设计一对引物:F 5′GTTACAATGTCACCCCACA3′; R 5′CACCATCTCCAGGAA

　　GTCT3′，扩增包括1188A/C位点在内的片断，PCR产物全长644?bp。PCR扩增反应体系20?μL，内含基因组50?ng,dNTP各200?μmol/L，MgCl2 2.0?mmol/L，5×PCR缓冲液4?μL，Taq酶2?U，上、下游引物各10?pmol，三蒸水补至20?μL。PCR扩增反应条件：94?℃?预变性5?min，94?℃变性40?s，55?℃退火40?s,72?℃ 40?s,36个循环，最后72?℃延伸10?min。以上反应在PE480基因扩增仪进行。

　　1.2.3 限制性内切酶酶切 酶切体系为20?μL，其中PCR产物10?μL，10×酶切缓冲液2?μL，限制性内切酶Taq Ⅰ(购自NEB公司)4?U，三蒸水补至20?μL，混匀后65?℃水浴3?h。

　　1.2.4 凝胶电泳 取酶切产物10?μL，采用2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，以凝胶成像分析仪(UVI)显像观察电泳图确定基因型。包含C等位基因的片段可以被限制性内切酶Taq Ⅰ切为201?bp和443?bp，包含A等位基因的片段不能被切开，片段大小为644?bp。

　　1.3 统计学处理 根据所测位点各种基因型的分布计算基因型以及等位基因频率，并进行HardyWeinberg遗传平衡检验，判断样本的代表性。各基因型以及等位基因频率在病例组和对照组间的差异比较采用χ2检验以计算统计量P值，所有统计学分析均采用SPSS13.0分析软件。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 IL12B基因的3′UTR区单核苷酸位点1188A/C基因型电泳结果 采用PCRRFLP法分析该位点在人群中的基因型，1188A/C PCR扩增产物经Taq Ⅰ消化后可区分出3种基因型：AA基因型不被Taq Ⅰ消化，终产物为644?bp;AC基因型能消化后产生644、201、443?bp 3条带;CC基因型则为201、443?bp 2条带，结果见图1。

　　图1 IL12B基因1188A/C点酶切产物的聚丙烯酰胺电泳图像

　　M: DNA Marker;1，8：CC基因型; 2，3，5，7：AC基因型; 4,6,9：AA基因型

　　Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis figure of the digested prodnct of IL12B

　　Lane M: DNA marker; Lane1, 8: CC genotype; Lane2, 3, 5, 7: AC genotype; Lane4, 6, 9: AA genotype2.2 IL12B基因的3′UTR区SNP位点1188A/C的基因型、等位基因频率分析 见表2。根据电泳结果图判断并记录个体的基因型，通过χ2检验病例组与对照组在该位点基因型及等位基因频率分布，均符合HardyWeinberg平衡定律(P>0.05)。该位点的基因型以及等位基因频率在病例组与对照组差异无统计学意义。病例组[例(%)]对照组[例(%)]OR(95% CI)P值AA108(33.33)139(35.73)1AC155(47.84)185(47.56)1.078(0.7751.510)CC1.208(0.7851.858)0.689等位基因A371(57.25)463(59.51)1C277(42.75)315(40.49)1.097(0.8881.356)0.389

　　3 讨 论

　　慢性阻塞性肺疾病病程迁延、反复发作,进行性加重，可能形成特殊的免疫学调控体系。目前，对支气管哮喘由多种细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病已达到共识，但对COPD患者气道免疫学上的认识远不如哮喘那么深入。COPD也是由多种炎性细胞、炎性因子共同参与的气道慢性炎症,并且近年来在全球呈不断上升趋势,在其发生发展过程中，由于香烟、细菌、病毒等致病因子的相互作用，免疫细胞被激活而释放炎性因子, 如细胞因子、氧自由基、蛋白酶等，这些因子相互作用形成了一个网络，参与疾病的发生。COPD患者Th1/Th2细胞分化不平衡，免疫调节失衡，使机体生理防御、自身稳定和免疫监视的功能紊乱。同时有研究表示,COPD患者存在Th1优势现象[3];Majori等[4]实验证实，COPD患者的外周血有Th1优势现象。尽管COPD的病因目前尚不明确，但许多细胞因子如IL1,IL6,IL8,IL10,IL13等的编码基因已被证明是COPD重要的易感基因。

　　人体内的IL12主要由抗原提呈细胞(如单核细胞和巨噬细胞、树突状细胞)及B细胞产生，是一种重要的致炎细胞因子，分子量为70?kD,由M40?kD(p40)和35?kD(p35)两条多肽链组成，IL12B位于染色体5q31q33，编码p40，全长16?kb，在遗传学中研究发现此位置与免疫应答有关[5]。IL12功能包括：① 它可以调节免疫应答，活化CD4+的T细胞通过表面IL12等细胞因子受体，接受以IL12为主的细胞因子作用后，可增殖分化为Th1细胞，对Th1细胞的分化有决定性作用[6];② 抑制Th2特异性转录因子GATA3的转录;③ 促进NK细胞增殖、分化并增强Th1细胞IFNγ基因的转录[7]。而IFNγ主要由活化T细胞产生, 可促进IL12的生成,因此，两者之间可形成正反馈途径,共同调节Th亚群的分化。最近有研究发现IFNγ可能调节诱导细胞趋化因子(CXCL10)的表达[8]，诱导MMP12产生，抑制分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的产生，促进COPD气道炎症和肺气肿的过程。另外研究表明，在COPD患者肺部上皮细胞中IL12的表达明显升高[9]。考虑到IL12在免疫反应中的重要作用，而IL12B编码其组成的一个亚基，因此推测IL12B基因的突变可能会导致Th1/Th2平衡异常，从而在COPD的发病中发挥作用。目前文献未见到有关IL12B基因与COPD的关系的研究。IL12B基因中存在着若干个多态位点，其中在3′非翻译区的1188位点存在TaqI的限制性片段长度多态性，研究表明此多态性影响IL12B的转录[10]。因此，本研究选取山东地区汉族COPD患者324例和正常对照389例,对1188A/C位点进行多态性分析，对该位点在病例组与对照组中的基因型以及等位基因频率的分布进行检测，结果发现山东地区汉族人群IL12B1188 A/C多态基因型AA,AC,CC在病例组的频率分别为0.333?3、0.478?4和0.188?3，在对照组中分别为0.357?3、0.475?6和0.167?1，两组的P值为0.689，没有统计学意义，也就是说它在慢性阻塞性肺疾病的发生过程中未起到显著作用。COPD是多基因疾病，它与单基因病的区别在于后者由于基因突变产生异常的蛋白质或酶，导致功能异常引起疾病的发生，而前者则是多个基因与环境因素相互作用，即单纯一个易感基因本身不足以导致疾病，可能是一些分布在基因表达调控区域的突变，这些小效应突变，改变了基因的表达水平，影响基因的功能，从而导致疾病的发生。而其调节因素众多,调节机制复杂, 种族因素、人群分层及样本量大小的不同都可使基因频率分布不同;每个易感基因的作用也会受到其他基因的影响;本研究未对该基因的其他位点的相关性进行检测。因此，仍需要加大样本量，排除其他干扰因素，对该基因的其他多态位点与COPD的相关性进行研究，为进一步阐明基因在疾病发生中的作用机制提供理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] Hodge G, Nairn J, Holmes M, et al. Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood, bronchoalveolar lavage and intraepithelial T cells of COPD subjects[J]. Clin Exp Immunol, 2007, 150(1):2229.

　　[2] 姚婉贞.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订)[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(1):817.

　　[3] Grumelli S, Corry D B, Song L Z, et al. An Immune Basis for Lung Parenchymal Destruction in Chronic Obstructive Pulmonary Disease and Emphysema[J]. PLoS Med, 2004, 1(1):7583.

　　[4] Majori M, Corradi M, Caminat I, et al. Predominant TH1 cytokine pattern in peripheral blood from subjects with chronicobstructive pulmonary disease[J]. J Allergy Clin Immunol, 1999, 103(3):458462.

　　[5] Walley A J, Wiltshire S, Ellis C M, et al. Linkage and allelic association of chromosome 5 cytokine cluster genetic markers with atopy and asthma associated traits[J]. Genomics, 2001, 72(1):1520.

　　[6] Chang M, Saiki R K, Cantanese J J, et al. The inflammatory diseaseassociated variants in IL12B and IL23R are not associated with rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(6):18771881.

　　[7] Anderson E J, McGrath M A, Thalhamer T, et al. Interleukin12 to interleukin ‘infinity': the rationale for future therapeutic cytokine targeting[J]. Springer Semin Immunopathol, 2006, 27(4):425442.

　　[8] Hardaker E L, Bacon A M, Carlson K, et al. Regulation of TNFalphaand IFNgammainduced CXCL10 expression: participation of the airway smooth muscle in the pulmonary inflammatory response in chronic obstructive pulmonary disease[J]. FASEB J, 2004, 18(1):191193.

　　[9] Gessner C, Scheibe R, Wtzel M, et al. Exhaled breath condensate cytokine patterns in chronic obstructive pulmonary disease [J]. Respir Med, 2005, 99(10):12291240.

　　[10] Huang D, Cancilla M R, Morahan G, et al. Complete primary structure, chromosomal localisation, and definition of polymorphisms of the gene encoding the human interleukin12 p40 subunit[J]. Genes Immun, 2000, 1(8):515520.