葛根素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中一氧化氮水平的影响

　　作者：谭军　　作者单位：新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003;

　　【摘要】目的 研究葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中一氧化氮(NO)水平的影响，并探讨其发生的可能机制，为葛根素的临床应用提供理论依据。方法 72只雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、葛根素预处理组，每组24只。以大脑中动脉栓线阻断法(MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。以硝酸还原酶法测定脑组织中的NO水平。结果 大鼠脑缺血再灌注24 h、72 h、120 h脑组织中NO水平显著升高，葛根素预处理可显著降低缺血再灌注损伤大鼠脑组织NO含量。结论 葛根素预处理可以通过降低脑缺血再灌注损伤后脑组织中NO水平而起到神经保护作用。

　　【关键词】 葛根 预处理 一氧化氮 缺血再灌注

　　Influence of puerarin pretreatment on nitrous oxide content in brain tissues of rats with cerebral ischemiareperfusion injury　　TAN Jun，PAN Deng，SUN Zhaoyin　　1.Department of Neurology,the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China;　　2.Veteran Cadre Department,the First People′s Hospital of Xinxiang city,Xinxiang 453000,China;3.Department of ostgraduate,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China

　　Abstract: Objectives To observe the influence of puerarin pretreatment on nitrous oxide(NO) level in brain tissues of rats with local cerebral ischemicreperfusion injury,and to study its potential mechanism,and to provide the evidence for clinical application of puerarin.Methods Seventytwo SpranueDawley(SD) rats were randomly divided into three groups:sham operation group(SO group),cerebral ischemia reperfusion group (IR group)and puerarin pretreatment group(P group),and each group has 24 rats.The model of cerebral ischemiareperfusion injure was made by right side middle cerebral artery occlusion(MCAO).The level of NO in the brain tissue was determined by nitrate reductase method.Results After cerebral ischemiareperfusion 24 h、72 h、120 h,the levels of NO in the brain tissue were obviously higher in IR group than those in SO group(P<0.01).The levels of NO in the brain tissue were obviously lower in P group than those in IR group(P<0.05),but there was no significant difference in them between P group and SO group(P>0.05).Conclusion Puerarin pretreatment can protect brain tissues by decreasing the level of NO in brain tissues of rats with cerebral ischemicreperfusion injury.

　　Key words: puerarin;pretreatment;nitrous oxide;ischemiareperfusion

　　缺血性脑血管疾病是三大致死性疾病之一，具有较高的发病率、致残率和死亡率，严重危害人类的健康，有效治疗一直是医疗工作者追求的目标。近年来，中药在缺血性疾病治疗中的作用逐渐得到重视。葛根素是中药葛根中提取的有效成分之一，具有调节血管活性物质扩张血管、改善微循环，减轻钙超载等作用，已广泛应用于临床疾病的治疗[14]。研究表明，一氧化氮(nitrous oxide,NO)作为一种神经递质，在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。因而能减轻NO对脑组织损害的药物有望成为缺血性脑血管病治疗的靶点之一[5]。本实验以大脑中动脉缺血再灌注大鼠为实验模型，通过观察葛根素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织NO水平的影响，为葛根素的临床应用提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠72只(新乡医学院实验动物中心提供)，体质量(300±20)g，饲养于恒温净化通风动物房，自由进食和饮水，室温(25±2)℃。

　　1.2 主要药品和试剂

　　葛根素注射液：0.2 g，批号：060901，北京四环科宝制药有限公司;NO测定试剂盒：北京中杉金桥生物制剂有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物模型制作

　　参考Longa等[6]的方法制作大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occalusion MCAO)缺血再灌注模型，以200 g•L-1乌拉坦(5 mg•kg-1)腹腔注射麻醉成功后，仰卧位，于颈部皮肤常规纵行切口约2.5 cm，钝性游离左侧颈总动脉，结扎同侧颈总动脉近心端和颈外动脉分叉部，距颈总动脉末端约5 mm处剪口，将直径0.2 mm尼龙线沿颈内动脉方向插入，深度由分叉部计算约(18.0±0.5)mm，于颈内动脉近心端结扎该动脉，全层缝合切口。于脑缺血手术2 h后抽出尼龙线1 cm行再灌注，实验中保持大鼠体温(37.0±0.5)℃至苏醒，麻醉清醒后大鼠MCAO模型采用Zea longa评分法进行神经功能评分[7]，0分：无神经系统功能缺失症状，活动正常者;1分：不能完全伸展对侧前爪者;2分：出现左侧Horner征爬行时出现向右转圈者;3分：行走时身体向右侧偏瘫侧倾倒者;4分：不能自行走者，意识丧失者。评分为0分和4分者均被剔除。

　　1.3.2 实验分组

　　72只SD大鼠随机分为3组，每组24只，假手术组仅暴露双侧劲总动脉，但不结扎，30 min后缝合颈部切口;缺血再灌注组制备左侧大脑中动脉阻塞缺血模型，缺血2 h后再灌注;葛根素预处理组制备左侧大脑中动脉阻塞缺血模型术前3 d经腹腔注射葛根素注射液100 mg•kg-1，每日1次，共3次。各组大鼠分别按脑缺血再灌注处死动物时间的不同分为24 h、72 h、120 h 3个亚组，每亚组8只，分笼饲养。

　　1.3.3 标本制备

　　大鼠再灌注24 h、72 h、120 h后，脱颈处死，断头后迅速取脑，取双侧纹状体，用电子分析天平(0.2 mg)称重，按每100 mg组织加1 mL生理盐水，放入匀浆器中匀浆，匀浆时注意由1人操作，均匀用力向右旋转6次，以防止组织破坏程度不同，匀浆液放入事先准备好的容器中，2 000 r•min-1离心10 min，取上清液于-80 ℃低温冰箱保存，待实验全部结束后统一测定。

　　1.3.4 脑组织中NO含量的测定

　　应用硝酸还原酶法测定NO的代谢产物，反映NO浓度，取离心后的脑组织匀浆液放于室温下溶化，取上清液0.1 mL，严格按NO测定试剂盒说明书测定脑组织匀浆中NO含量，计算方式NO(μmol•L-1)=(样品管OD)/(标准管OD)×100。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 13.0统计软件分析，组间比较采用t检验和单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　缺血再灌注组24 h、72 h、120 h时间点脑组织NO含量均较假手术组相对应时间点明显增高(P<0.01);葛根素预处理组24 h、72 h、120 h时间点脑组织NO含量均低于缺血再灌注组相对应时间点(P<0.05)，但与假手术组相对应时间点比较无显著性差异(P>0.05)。见表1。表1 3组大鼠不同时间脑组织中NO含量(略)

　　3 讨论

　　缺血再灌注损伤是临床上常见的基本病理生理过程，人们对它进行了大量的相关研究[79]。葛根素是由豆科植物野生葛根中提取的，化学结构为8β吡喃葡萄糖47二羟基异黄酮甙[2]，具有调节血管活性物质、扩张血管、改善微循环、减轻钙超载等作用。

　　NO是迄今在体内发现的第1个气体性信息分子，资料表明，NO在脑缺血再灌注损伤中具有双重作用[10]，目前，研究提示NO产生在最初几小时具有保护作用，随后则产生神经毒性作用[1112]，1993年Malinski[13]和Tominage[14]分别用电极法和电子偏磁共振技术证实局灶性脑缺血后5～10 min NO突然持续升高，30 min后达高峰，但以后又缓慢降至正常水平，再灌注时脑缺血后期NO又再次升高。本研究结果显示，NO含量在葛根素预处理组均较缺血再灌注组低，其降低的原因，作者认为有2种，其一未达到晚期NO升高的时间，其二葛根素预处理通过抑制一氧化氮合酶对晚期NO升高有抑制作用，从而具有了神经保护作用，具体原因有待进一步研究。有研究表明，葛根素对脑缺血再灌注的大鼠具有降低自由基的毒性，减小神经细胞的异常凋亡和减轻炎症作用。本研究结果与王姿颖等[15]的报道相符。葛根素通过降低缺血再灌注区脑组织中NO的含量而对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用，但缺血再灌注脑损伤的发生机制复杂，各种因素间可能相互促进、相互影响，葛根素究竟是通过直接还是间接途径降低NO的神经毒性，值得进一步研究。

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