散发性帕金森病Parkin基因突变检测

　　作者：刘珂,滕继军,王修海　　作者单位：青岛大学医学院生物学教研室，山东 青岛 ; 青岛大学医学院附属医院神经内科

　　【摘要】目的 探讨散发性帕金森病病人Parkin基因的突变情况。方法 应用聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCRSSCP), 对18例帕金森病病人和20例正常人Parkin基因的第3、4、5、6、7外显子突变情况进行检测分析。结果 4例病人有Parkin基因第3外显子点突变， 1例病人有Parkin基因第4外显子点突变，2例病人有Parkin基因第5外显子点突变。所有病例均未检测到Parkin基因外显子缺失突变。结论 散发性帕金森病病人中存在Parkin基因点突变，Parkin基因点突变可能是散发性帕金森病发病原因之一。

　　【关键词】 帕金森病;Parkin基因;点突变

　　帕金森病(PD)是一种由多因素、多个基因相互作用而产生的缓慢进展的神经系统变性疾病。目前人们对其确切的发病机制尚不清楚[1，2]。在对家族性PD相关基因的研究中已经发现10个染色体位点以孟德尔遗传方式与PD基因连锁。目前，已有αsynuclein基因、Parkin基因、DJ1基因和UCHL1基因被克隆[3]。其中，人们对Parkin基因的研究最为广泛。1998年，KITADA等[4]首次发现并克隆了Parkin基因，并发现了此基因外显子的缺失。随后的大量研究结果证实，遗传性Parkin基因的突变具有明显的多样性，该基因的12个外显子均有不同程度的序列改变，其中以4、6、7最为常见，它们都处于突变的热点区域。据统计，目前我国PD病人已逾百万，其中许多是散发性PD, 因此，研究散发性PD病人中Parkin基因的突变情况具有一定的临床意义。本研究应用聚合酶链反应单链构象多态(PCRSSCP)技术，对散发性PD病人Parkin基因的5个外显子进行检测分析，以了解散发性PD病人Parkin基因的突变情况。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　PD病人18例，系2007年8月～2008年5月在青岛大学医学院附属医院神经内科PD专科门诊就诊的散发性PD病人，均符合中华医学会2006年制定的PD临床诊断标准[5]，其中男11例，女7例，年龄40～80岁，平均57岁。对照组20例，系同期该院门诊健康查体者，无神经系统遗传病家族史，排除肿瘤及神经系统疾病，其中男10例，女10例，年龄30～50岁。

　　1.2 检测方法

　　1.2.1 基因组DNA的提取 分别取受检者静脉血2 mL，EDTA抗凝，使用上海生工生物工程公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃冰箱冻存。

　　1.2.2 PCR引物的设计 参照 KITADA等[4]方法设计Parkin基因第3、4、5、6、7外显子的引物，序列见表1。引物由上海生工生物工程公司合成。

　　1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系含：DNA样品3 μL,2 mol/L dNTP 2.5 μL,两条20 pmol/L引物各1 μL,10×PCR缓冲液2.5 μL, TaqDNA聚合酶0.25 μL,加去离子双蒸水至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35个循环，再72 ℃延伸7 min。PCR试剂均购自上海生工生物工程公司。

　　1.2.4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 将PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外线灯下观察确定基因是否有缺失突变。对有外显子缺失的标本,以βactin为内对照,与内对照引物共同扩增,证实缺失。

　　1.2.5 SSCP分析 将60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶在150 V恒压、20 A恒流条件下先行预电泳30 min。取PCR产物7 μL，加7 μL变性液(含有9.8 g/L甲酰胺，10 mol/L NaOH，20 mol/L EDTA，0.50 g/L溴酚兰，0.50 g/L二甲苯氰)，98 ℃变性10 min，冰浴10 min后上样，150 V恒压、20 A恒流条件下电泳2 h。取胶，固定、银染、显色后观察结果并拍照。

　　2 结果

　　2.1 Parkin基因第3～7外显子PCR扩增

　　18例散发性PD病人及20例正常对照者基因组DNA Parkin基因第3～7外显子PCR扩增分别获得427、261、227、268和239 bp大小的特异性扩增产物，未见Parkin基因外显子的缺失改变。

　　2.2 Parkin基因第3～7外显子PCRSSCP检测

　　4例病人第3外显子有单链泳动变位(图1)，1例病人第4外显子有单链泳动变位(图2)，2例病人第5外显子有单链泳动变位(图3)。

　　3 讨论

　　PD按遗传方式可分为家族性与散发性两种，家族性PD约占PD总数的10%～15%，具有明显家族遗传倾向;而散发性PD则占PD的绝大多数，无明显遗传倾向，但表现为某种遗传易感性。早期发现的Parkin基因主要存在于少年型遗传性PD病人中，但最新研究表明，Parkin基因外显子的突变并非少年型PD所特有，无论是家族性还是散发性PD、无论年轻时发病还是年老时发病的病人中均存在不同程度及类型的Parkin基因突变[6]。这既说明Parkin基因在PD的遗传学机制中起着十分重要的作用，同时又说明PD发病机制具有复杂性。Parkin基因长500 kp，包括12个外显子。国外研究显示，外显子3和外显子4 缺失最多见，点突变多发生在外显子2、7、9。国内的学者也发现了外显子1～8 的突变;其中，外显子缺失者多见于外显子4和7，点突变多见于外显子2 和7。LUCKING等[7]对来自5个国家的12个常染色体隐性遗传的青少年型帕金森综合征(ARJP) 家族进行筛查，研究Parkin基因外显子的缺失与表型的关系，认为不同的家系可能有不同的外显子缺失，从而产生不同的表型特征，这与外显子的功能分工有关[8]。其后，许多学者相继在ARJP家族病人的Parkin基因外显子中发现了诸多点突变，并提出在PD发病机制中点突变比缺失突变的意义更大。王涛等[9]经测序证实1例早发性PD病人的外显子7中存在一个未曾报道过的新的点突变位点Gly284Arg，并认为Parkin基因点突变也是我国早发性PD病人的致病原因之一。徐严明等[10]研究推测，Parkin基因外显子1、2突变可能与部分散发性早发PD发病有关。本研究在18例标本中没有发现Parkin基因相关外显子缺失，可能与PD病人标本的类型有关。目前有研究显示，Parkin基因的突变类型与PD的遗传类型具有一定的相关性，家族性PD主要表现为大片段外显子的缺失突变，而散发性PD主要以Parkin基因的点突变为主。本研究应用PCRSSCP技术对18例散发性PD病人标本进行检测，结果显示，Parkin基因外显子3、4、5均有突变发生。这与王涛等[9]研究结果类似，也与PD的临床发病规律相吻合。可见点突变比缺失突变更多见，Parkin基因外显子突变可能与部分散发性PD发病有关。

　　表1 Parkin 基因第3～7 外显子引物序列引物名称(略)

　　图1 Parkin基因第3外显子SSCP检测(略)

　　M1、M2为标准分子质量Marker，①、②为PD病人，③～⑥为正常对照者

　　图2 Parkin基因第4外显子SSCP检测(略)

　　M1、M2为标准分子质量Marker，③为PD病人，①、②、④为正常对照者

　　图3 Parkin基因第5外显子SSCP检测(略)

　　M1、M2为标准分子质量Marker，①为PD病人，②～④为正常对照者

　　目前，国内外研究人员发现的各相关基因都只能解释部分家族性PD的发病原因，且即使是同一基因在不同人群中突变的性质和部位也有所不同，这表明不同人种和地域的PD 病人可能存在不同的致病基因，或有一普通存在的致病基因而目前尚未被发现。筛查不同人群的PD 相关基因，寻找更为普通存在的致病基因的工作还有待深入进行。

　　【参考文献】

　　[1]陈彪,刘焯霖,王枫,等. 中国帕金森病遗传研究进展[J]. 中华神经科杂志, 2005, 38(3):160163.

　　[2]谢安木,薛莉,刘焯霖. Synphilin1寡核苷酸对帕金森病酪氨酸羟化酶表达的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(3):199.

　　[3]TODA T, MOMOSE Y, MURATA M, et al. Toward identification of susceptibility genes for sporadic Parkinson’s disease[J]. J Neurol, 2003,250(Suppl 3):4043.

　　[4]KITADA T, ASAKAWA S, HATTORI N, et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile Parkinsonism[J]. Nature, 1998,392:605.

　　[5]中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组. 帕金森病的诊断[J]. 中华神经科杂志, 2006,39(6):408409.

　　[6]李立宏,高国栋. 帕金森病基因突变多态性与其家族性和散发性的关系[J]. 中国临床康复, 2005,9(17):1315.

　　[7]LUCKING C B, DURR A, BONIFATI V, et al. Association between early onset Parkinson’s disease and mutation in the parkin gene[J]. New Engl J Med, 2000,342:15601567.

　　[8]HEDRICH K, ESKELSON C, WILMOT B, et al. Distribution, type, and origin of Parkin mutations: review and case studies[J]. Mov Disord, 2004,19:11461157.

　　[9]王涛,梁直厚,孙圣刚,等. 帕金森病患者Parkin基因点突变[J]. 中国临床康复, 2003,7(13):1892.

　　[10]徐严明,刘焯霖,陈彪,等. 散发性早发帕金森病Parkin基因1、2号外显子突变的研究[J]. 中山医科大学学报, 2001,22(3):209221.