轻度认知功能障碍患者淋巴细胞糖原合成酶激酶3活性的变化

　　作者：李亮,王建华,曲忠森　　作者单位： 潍坊医学院附属胶州中心医院神经科[李亮(现在咸宁学院医学院临床医学系)，王建华];上海市浦东新区人民医院神经科(曲忠森)

　　【摘要】目的 探讨轻度认知功能障碍(MCI)患者淋巴细胞糖原合成酶激酶3(GSK3)活性的变化。方法 应用免疫印迹法检测不同病程(1年，2年，3年)MCI患者及正常老年人(正常对照组)外周血淋巴细胞GSK3β Ser9位点的磷酸化水平及总GSK3β水平。结果 1年，2年及3年MCI组淋巴细胞GSK3β Ser9位点磷酸化水平比正常对照组显著降低(均P<0.01);总GSK3β水平与正常对照组相比差异无统计学意义;MCI组间淋巴细胞GSK3β Ser9位点磷酸化水平及总GSK3β水平差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 MCI患者淋巴细胞GSK3的活性升高，对MCI的诊断可能有参考价值。

　　【关键词】 轻度认知功能障碍 淋巴细胞 糖原合成酶激酶 3

　　Change of glycogen synthase kinase3 activity in lymphocytes in patients with mild cognition impairment

　　LI Liang, WANG Jianhua, QU Zhongsen.

　　Department of Neurology, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, Jiaozhou 266300, China

　　Abstract：Objective To explore the change of glycogen synthase kinase3(GSK3) activity in lymphocytes in patients with mild cognition impairment(MCI). Methods The phosphorylation of GSK3β at Ser 9 site and total level of GSK3β in peripheral blood were measured by Westernblot in normal control group, oneyear MCI group, twoyear MCI group and threeyear MCI group. Results The phosphorylation of GSK3β at Ser 9 site were lower in 1year MCI group, 2year MCI group and 3year MCI group, compared with normal control group(all P<0.01).There were not significant difference in total level of GSK3β among MCI group and normal control group and in phosphorylation of GSK3β at Ser 9 site and total level of GSK3β in MCI group(allP>0.05). Conclusion The activity of GSK3 in lymphocytes in MCI patients is raised, which implies a subsidiary value of MCI diagnosis.

　　Key words：mild cognition impairment; lymphocyte; glycogen synthase kinase3

　　轻度认知功能障碍(MCI)被认为是一种介于老年记忆减退和痴呆之间的过渡状态，研究[1]显示MCI 患者1年内约有10%～15%、2年内40%、3年内20%～53%、4～5年55%发展成为Alzheimer 病(AD)。由于MCI患者的脑组织活检及脑脊液(CSF)采集存在困难，外周血生物学检测方法是近年的研究热点。MCI患者外周生物液中磷酸化tau蛋白(Ptau)含量升高、β淀粉样蛋白(Aβ)142含量降低被认为对MCI有诊断价值[2]。糖原合成酶激酶3(GSK3)在AD疾病过程中不仅参与Aβ的产生，而且与tau蛋白的过度磷酸化密切相关[3]。而Aβ的过量产生与tau蛋白的异常过度磷酸化是形成AD两大病理学特征的基础。有研究[4]报道在AD及MCI患者的外周血白细胞中GSK3活性水平异常升高[4]。对于MCI患者外周血淋巴细胞GSK3的活性有何变化，尚未见报道。本研究检测不同病程MCI患者外周血淋巴细胞GSK3β Ser9位点磷酸化及总GSK3β表达水平的变化，探讨其对MCI的诊断作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 (1)MCI组：系我院2005年10月～2006年12月门诊的MCI患者 30例，男16例，女14例;年龄63～74岁，平均(68.4±5.6)岁;病程11～37个月，平均(23.97±9.94个月)，病程为1年、2年、3年的MCI患者均为10例;平均受教育(7.8±3.5)年;符合美国《精神疾病诊断分类与统计手册》第4版(DSMⅣ)中的MCI研究用标准及Petersen提出的MCI诊断标准[5,6]。(2)正常对照组：为同期健康老年志愿者11名，男6名， 女5名;年龄66～78岁， 平均(72.4±5.8)岁;平均受教育(7.2±2.4)年;均无严重躯体疾病;认知功能、远近记忆力、生活能力及社交能力等检查无明显异常。两组均排除心、肝、肾、肺疾病，无脑外伤、脑卒中、脑部感染疾病及精神病史。年龄和受教育程度差异无统计学意义(均P>0.05)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 GSK3β Ser9位点磷酸化水平及总GSK3β水平检测 MIC组在就诊次日、正常对照组在体检日采取静脉血6 ml，置于肝素抗凝管用PBS等量稀释，将6 ml稀释的血细胞液加入15 ml离心管，然后将3 ml淋巴细胞分离液(LympholyteH) 沿管壁加入，离心20 min，用细吸管从界面上小心吸取淋巴细胞，并转移到另一离心管。用PBS稀释细胞，离心10 min，弃上清。将沉淀用PBS冲洗3次，再将细胞用PBS稀释成(4～10)×106的悬液。加入100 ml细胞裂解液，超声破碎(10 s，3次)，离心10 min取上清，采用二喹啉甲酸蛋白测定法(BCA)测定蛋白质浓度，-70℃冰箱保存。用免疫印迹法检测GSK3β Ser9位点的磷酸化水平。上清液加入1/3体积4×上样缓冲液(终浓度为0.1 mol/L Tris，pH 6.8，4%SDS，20%甘油)，沸水中变性10 min，冷却后备用。用10%聚丙烯酰胺分离胶，将蛋白质提取物分离并转印到硝酸纤维膜上。用5%脱脂牛奶室温下封闭1 h。5%脱脂牛奶稀释的特异性识别GSK3β Ser9位点的抗体 (1∶1000稀释) 37℃孵育2 h，0.05 mol/L TBS缓冲液(pH 7.5)漂洗，再用5%脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶30000稀释)37℃孵育1 h，0.05 mol/L TBS缓冲液漂洗，ECL显色10 min。采用Kodak图像分析系统及ImageProplus 软件分析结果。每个样本均经3次检测，取平均值。

　　1.2.2 统计学方法 检测结果用均数±标准差(±s)表示，用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 MCI组与正常对照组淋巴细胞GSK3β Ser9位点磷酸化水平比较 见表1。MCI病程为1年、2年、3年组患者外周血淋巴细胞GSK3β Ser9位点的磷酸化水平均比正常对照组明显降低(均P<0.01);MCI各病程组之间差异无统计学意义。

　　2.2 MCI组与正常对照组总GSK3β水平比较 见表1。

　　表1 MCI组与对照组淋巴细胞GSK3β Ser9位点磷酸化及总GSK3β水平比较(略)

　　注：与正常对照组比较*P<0.01

　　MCI组与正常对照组总GSK3β水平差异无统计学意义;MCI病程1年组、2年组、3年组之间差异无统计学意义。

　　3 讨论

　　AD是一种中枢神经系统退行性疾病，主要表现为进行性记忆减退和认知功能障碍。MCI被认为是一种介于老年记忆减退和痴呆之间的过渡状态，如果能够早期识别MCI,并通过相应的干预，将对AD的预后起积极的作用。

　　对于AD及MCI的生物学标志物的检测近年来已有报道，CSF中参与AD病理过程的蛋白，如tau蛋白、Aβ142、淀粉样前体蛋白(APP),载脂蛋白 E(ApoE)已经被广泛研究[7-9]。目前认为CSF中Aβ降低, 增高的CSFtau及CSF Ptau可以将AD与其他神经退行性疾病区分出来。在MCI患者CSF中这些蛋白存在类似的改变，可以作为诊断MCI的生物学标记物。但是免疫阵列和蛋白质组学的结合研究显示[10]：在AD、帕金森病(PD)、额颞叶痴呆(FTD), 这些蛋白质表达虽然不同，但对疾病的发生、发展的诊断仍缺乏特异性。研究[3]证实： GSK3不仅参与tau蛋白过度磷酸化，而且也与Aβ的产生和聚积密切相关。动物实验[11]也证实GSK3β的过度活化与tau蛋白过度磷酸化以及动物的空间记忆损伤程度正相关。而GSK3β Ser9位点的磷酸化水平降低是GSK3活性升高的原因[12]。Hye等[4]证实在AD及MCI患者外周血白细胞中GSK3的表达升高;但对于GSK3在不同MCI病程的变化未做相应的研究。本研究检测正常老年人及病程为1年、2年、3年的MCI患者外周血淋巴细胞GSK3的活性变化，结果显示不同病程 MCI患者GSK3β Ser9位点的磷酸化水平比正常对照组明显降低(均P<0.01),提示MCI患者GSK3活性比正常老年人明显升高，并且，MCI 2年病程患者的GSK3活性升高最为明显。随着病程的进展，MCI 3年病程患者外周血淋巴细胞GSK3活性有降低，但是与病程1年及2年患者之间的差异无统计学意义。这是否与机体的自我代偿有关，尚需要对更长病程患者作进一步观察。

　　总之，本研究证实了MCI患者外周血淋巴细胞GSK3β活性明显升高，提示GSK3在MCI诊断中可能有诊断价值。

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