糖尿病脑梗死大鼠血管内皮生长因子及其受体表达水平的变化

　　作者：徐晓云,李刚　　作者单位：上海，同济大学附属东方医院神经内科

　　【摘要】目的 研究糖尿病脑梗死(DMCI)早期半暗带等值区血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(FLT1，FLK1 )表达水平的变化。方法 建立DMCI大鼠模型，在脑缺血后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h，采用原位杂交方法测定大鼠大脑缺血半暗带等值区VEGF、FLT1、FLK1 mRNA的表达水平;并与无糖尿病的脑梗死(NDMCI)大鼠比较。结果 DMCI组在脑缺血后各时间点脑缺血半暗带等值区VEGF mRNA的表达水平均显著低于NDMCI组(P<0.05～0.01)，FLK1 mRNA 表达水平在脑缺血后12 h显著低于NDMCI组(P<0.01)，FLT1 mRNA 表达水平在脑缺血后各时间点(除6 h)与NDMCI组差异无统计学意义。结论 DMCI早期VEGF和FLK1 mRNA表达水平降低，这可能是DMCI血管、神经病变重的原因之一。

　　【关键词】 糖尿病,脑梗死,血管内皮生长因子 FLT1 FLK1

　　Abstract：Objective To study the changes of expression levels of vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptors (FLT1，FLK1) mRNA in equal area of penumbra in diabetes rats with cerebral infarction(DMCI). Methods Middle cerebral artery occlusion (MACO) model was made in diabetes rats. The expression levels of VEGF and FLT1，FLK1 mRNA in equal area of penumbra were measured with situ hybridization in different times after MACO (1 h,3 h,6 h,12 h,24 h). The difference was compared between DMCI group and no diabetes cerebral infarction (NDMCI) group. Results The expression level of VEGF mRNA was lower in DMCI group than that of NDMCI group at every time point (P<0.05 ～ 0.01). The expression level of FLK1 mRNA was lower (P<0.01) at 12 h after MACO in DMCI group than that in NDMCI group. Except for at 6 h, there was no significant difference between DMCI and NDMCI group in the expression level of FLT1 mRNA. Conclusion The expression levels of VEGF and FLK1 mRNA are reduction in DMCI early period, which may be partly responsible for poor prognosis in diabetes mellitus cerebral infarction.

　　Key words：diabetes; cerebral infarction; vascular endothelial growth factor; FLT1;FLK1

　　血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(FLT1,FLK1)是脑缺血后血管形成、神经保护和脑水肿的关键生物因子。在糖尿病慢性缺血性病变中，VEGF在缺氧因素刺激下常反应性增高。而其在急性糖尿病性脑缺血病变时的表达水平变化未见报道。为此，本研究选择对脑梗死治疗及预后具有决定性影响的缺血半暗带为目标区域，观察糖尿病脑梗死(DMCI)后VEGF及FLT1、FLK1 mRNA表达水平的变化，以期为临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组 清洁级SD大鼠40只，雌雄不拘，质量200～250 g，由中国科学院上海分院动物部提供。随机分为DMCI组与无糖尿病的脑梗死(NDMCI)组，每组20只，再分为脑缺血后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 5个亚组，每亚组4只大鼠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 糖尿病大鼠模型制作 DMCI组大鼠禁食12 h后，腹腔内注射链脲佐菌素(溶于0.1 mol/L pH 4.2的柠檬酸缓冲液，新鲜配制) 55 mg/kg。5 d后，大鼠出现多饮、多食、多尿，1周后测空腹血糖>16.7 mmol/L者为糖尿病模型;连续高脂饮食饲养6周。

　　1.2.2 脑梗死大鼠模型制作 参照Koizumi和Zea Longa线栓法制作大脑中动脉阻塞(MACO)模型。将两组大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后仰卧位固定，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总、翼额、颈外动脉。在颈总动脉分叉处近端剪开一小口，用0.25 mm尼龙线插入颈内动脉约17 mm，遇轻微阻力后阻塞大脑中动脉起始处，线栓固定。术中及麻醉期间小电热毯维持动物直肠温度36.5～37℃,注意观察呼吸及心率变化。

　　1.2.3 组织取材 在预定时间麻醉各亚组大鼠后，经左心室快速灌注生理盐水150 ml冲洗血管，然后以1.5%戊二醛、4%多聚甲醛 250 ml缓慢灌流1 h。参照文献[1]报道的方法，采用组间等位定位法设定半暗带的等值区。低温剥取右侧大脑距离嗅球尖端7～11 mm之间、大脑矢状裂至外侧裂上1/3皮质组织块。

　　1.2.4 VEGF、FLT1、FLK1 mRNA的表达水平检测(1)探针制备：根据NCBI公布的SD大鼠VEGF、FLT1及FLK1的序列设计引物，并以SD大鼠正常脑组织cDNA为模板进行PCR扩增，产物经测序验证正确后，采用PCR产物回收试剂盒进行纯化;采用Roche公司DNA标记和检测试剂盒Ⅰ对PCR产物进行地高辛标记得到相应的探针。按照以下引物序列扩增探针，各引物序列为：VEGF：F 5′TGC ACT GGA CCC TGG CTT TAC3′，R 5′CGG CAA TAG CTG CGC TGG TAG3′;FLT1：F 5′TTT TGT TTG TTG TCG CTG TT3′，R 5′TCG TTT GCT GTT CTC CCT3′;FLK1：F 5′GTG AAG CCA TCA ACA AAG3′，R5′TGG AAT GCC ACA ATC AAG3′。(2)杂交方法：组织块迅速经DEPC处理的4%多聚甲醛进行后固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，连续切片，厚度5～8 μm，粘片，脱蜡。蛋白酶K(200 μm/ml)处理，37℃ 30 min，TrisGlycine漂洗终止反应，4%多聚甲醛4℃平衡5 min后，2×SCC漂洗15 min，每张切片滴加杂交液进行预杂交2 h，移去杂交液，滴加含有探针的杂交液，并以不含探针的杂交液作为对照，42℃ 杂交过夜。用SCC进行充分的漂洗，最后加适量的氮蓝四唑/溴氯吲哚磷酸盐(NBT/BCIP)，避光室温显色，显微镜观察显色情况。待显色充分后用5×TE终止反应，封片。(3)图像分析：采用Leica Q WC图像分析系统，放大200倍输入图像，采用相同参照测定相对灰度值作为表达水平。

　　1.2.5 统计学方法 检测数据以均数±标准差(±s表示)，用SPSS 10.0 软件进行t检验。

　　2 结果

　　DMCI组与NDMCI组大鼠均发现VEGF mRNA在神经元、胶质细胞中有表达，而FLT1与FLK1 mRNA 表达于血管内皮细胞。两组VEGF、FLT1、FLK1 mRNA表达水平的动态变化见表1。DMCI组VEGF mRNA表达在缺血后24 h内均处于较低水平。NDMCI组VEGF mRNA表达水平在缺血后3 h开始升高，至12 h达到高峰，而后下降;FLT1与FLK1 mRNA表达在缺血后24 h内均处于较低水平。两组FLK1 mRNA表达水平的趋势不同：NDMCI组逐渐增加，DMCI组逐渐下降，但至脑缺血后24 h DMCI组再次升高。

　　在脑缺血后各时间点DMCI组VEGF mRNA表达水平均明显低于NDMCI组(P<0.05～0.01)。DMCI组FLT1 mRNA表达水平在脑缺血后6 h 显著低于NDMCI组(P<0.01)，其他时间点差异无统计学意义;FLK1 mRNA表达水平在脑缺血后1 h显著高于NDMCI组，脑缺血后12 h显著低于NDMCI组(均P<0.01)。

　　表1 DMCI组与NDMCI组VEGF、FLK1及FLT1 mRNA表达水平比较(略)

　　注： 与NDMCI组比较 *P<0.05,△P<0.01

　　3 讨论

　　尽管缺血半暗带的重要性早已得到公认，但由于可逆性缺血变为不可逆性梗死是一个动态的过程，而不是固定时间内的全或无现象，故目前不能直接进行统一的组织定位和时限界定。多数研究认为在脑梗死后24～72 h，半暗带内均存在可以挽救的神经元。国内报道[2]临床溶栓治疗时间窗最长为24 h。因此，为控制方法学上的不确定性，本研究采用被以往严格动物实验证实的组间等位法进行等值区研究，时间上以脑缺血后24 h为研究时限。

　　本研究显示，与NDMCI组相比，DMCI组半暗带等值区内VEGF及其受体FLT1、FLK1 mRNA的表达具有以下特点：在空间上，两组VEGF mRNA均在神经元和胶质细胞有表达，而FLT1、FLK1 mRNA 均表达于血管内皮细胞;在时间与表达量上，DMCI组VEGF mRNA在脑缺血后24 h均处于低水平表达，且FLK1 mRNA 在脑缺血1～12 h内逐渐下降。既往研究[3]用PCR方法检测同样模型大鼠同样部位和时间VEGF mRNA，DMCI大鼠亦呈低水平表达。本实验证明DMCI和NDMCI在局灶脑缺血早期缺血半暗带中存在VEGF及其受体mRNA表达的差异，值得研究探讨。

　　急性脑梗死后，在缺血半暗带内VEGF通过与其受体结合，对神经系统具有多重保护作用，涉及血管形成、促进神经发生、直接的神经营养和神经保护及抗凋亡等多种机制[46]。在本实验中，NDMCI组大鼠内源性VEGF及其受体mRNA表达上调反映了机体的自然防御机制。而在DMCI组大鼠中，这种自然防御机制明显不足：一方面，DMCI组VEGF mRNA在脑缺血后24 h内均处于低水平表达，并未出现NDMCI组的表达高峰，因此不可能在半暗带存在的有限时间内实现VEGF的保护作用;另一方面，DMCI组FLK1 mRNA在脑缺血后1～12 h内逐渐下降，不仅削弱了内源性VEGF的自然防御机制，而且也限制了外源性VEGF的应用。文献[7]报道，VEGF主要通过FLK1实现促进血管和神经生成以及神经保护的作用。在本实验中， FLT1与FLK1mRNA在DMCI组和NDMCI组中均呈低水平表达。FLT1的表达水平在两组中差异不明显，其中脑缺血后6 h两组间的明显差异主要由于NDMCI组的升高所致。FLK1 mRNA的表达水平在NDMCI组逐渐增加，而DMCI组在脑缺血后1～12 h却逐渐下降。以上结果表明，同NDMCI相比， DMCI组的VEGFFLK1通路显然存在障碍。

　　抑制VEGFFLK1通路对于实验性脑梗死具有重要影响。已有动物实验[8，9]表明，在急性局灶脑缺血后通过侧脑室注入VEGF抗体，或者使用FLK1受体抑制剂，可以导致新生血管减少、神经再生阻滞、梗死体积扩大，最终神经功能恶化。结合本研究结果，推测VEGFFLK1通路障碍可能是造成临床上DMCI患者致残率高于NDMCI的机制之一。另一方面，VEGF与其受体结合还可以导致血脑屏障通透性增加和脑水肿。文献报道[10]，在MACO后早期(1 h)给予VEGF治疗可以引起血管源性水肿增加和死亡率上升，而24～48 h后给予外源性VEGF，则积极作用大于其不利影响，可以改善神经功能，后者在时间上与内源性VEGF受体通路实际发挥作用的时间相一致。因此，DMCI后VEGFFLK1通路障碍在理论上可能具有减轻血管源性脑水肿的积极意义，但实验显示其反面的不利影响起主要作用。

　　本实验结果尚不能解释造成DMCI后VEGF FLK1通路障碍的原因。在NDMCI局灶脑缺血早期，VEGF与受体mRNA表达水平上调。在糖尿病慢性缺血性病变的研究中，如糖尿病视网膜病变或肾病，均发现缺氧等因素导致VEGF 与受体mRNA表达也上调。前者有利于缺血区血管再生，神经功能恢复;后者导致血管异常增生性病变。本实验是观察糖尿病急性缺血性病变，推测长期高血糖等代谢因素可能引起神经元、胶质细胞等组织的应激功能下降，基因或转录调节障碍。由于外源性VEGF难以透过血脑屏障，以VEGF及其受体通路为基础的治疗目前难以在蛋白水平实现，而在脑内调节VEGF及其受体FLK1 mRNA的表达更具有现实意义，因此DMCI后VEGF和FLK1 mRNA表达水平低的机制值得进一步研究。

　　总之，本研究发现，同NDMCI相比，DMCI后VEGF和FLK1(12 h) mRNA表达水平降低，这可能是造成DMCI神经功能障碍重的主要原因。

　　【参考文献】

　　[1]Shi J，Panickar KS, Yang SH，et al. Estrogen attenuates overexpression of βamyloid precursor protein messager RNA in an animal model of focal ischemia[J].Brain Res,1998, 810: 87.

　　[2]徐晓云, 赵庆杰, 王德生, 等. 对急性脑梗死超时间窗溶栓的研究[J]. 中国急救医学,2000,20:337.

　　[3]徐晓云,李刚，左联. 糖尿病鼠局灶脑缺血早期VEGF mRNA的表达 [J].上海第二医科大学学报，2005，25：1130.

　　[4]张微微,李远征,裘林秋,等. 步长脑心通胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J].临床神经病学杂志，2006，19：118.

　　[5]Schanzer A, Wachs FP, Wilhelm D, et al.Direct stimulation of adult neural stem cells in vitro and neurogenesis in vivo by vascular endothelial growth factor[J].Brain Pathol,2004,14:237.

　　[6]Wang Y, Kilic E, Kilic U, et al. VEGF overexpression induces postischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena[J].Brain,2005,128:52.

　　[7]Khaibullina A, Rosenstein JM,Krum JM. Vascular endothelial growth factor(VEGF) promotes neurite maturation in primary CNS neuronal cultures[J]. Brain Res Dev Brain Res,2004,148:59.

　　[8]Bao WL, Lu SD, Wang H, et al. Intraventricular vascular endothelial growth factor antibody increases infarct volume following transient cerebral ischemia[J].Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao,1999,20:313.

　　[9]Louissaint A, Rao S, Leventhal C, et al. Coordinated interaction of neurogenesis and angiogenesis in the adult songbird brain[J].Neuron,2002, 34:945.

　　[10]Zhang ZG. VEGF enhances angiogenesis and promotes bloodbrain barrier leakage in the ischemic brain[J]. J Clin Invest, 2000,106:829.