Ⅰ期非小细胞肺癌纵隔淋巴结中肺特异性蛋白X mRNA表达与微转移及预后的关系

肺癌是人类常见的恶性肿瘤,其中I期非小细胞肺癌(NSCLC)预后最佳,但其复发率仍然达25%-50%,可能的原因就是淋巴结等存在肿瘤微转移,而纵隔(NZ)淋巴结转移更是患者预后不良的重要标志.我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测肺特异性蛋白X(LUNX)mRNA在I期NSCLC肿瘤组织和N,淋巴结中的表达,探讨其与微转移及预后等的相关性.
    材料与方法
    1一般资料:选取2005至2010年南京市胸科医院160例术后病理确诊为I期非小细胞肺癌患者,术前均未行放、化疗,术中均行系统性纵隔淋巴结清扫术,清扫淋巴结大于6组,包括隆突下淋巴结.患者年龄28一80岁,中位年龄57.3岁;其中男94例,女66例;术后按照第7版国际抗癌联盟(UICC)标准病理分期,IA期(TlaNOMO,TlbNOMO)82例,IB期(T2aNOM0)78例,腺癌101例,鳞癌59例.取部分肺癌组织及隆突下(NZ)淋巴结,同时取10例肺良性疾病患者淋巴结10枚,所有标本均取自病理科石蜡切片,置于一80℃妥善保存自手术日起随访至患者死亡或者末次随访日为2012年5月1日,随访过程中若出现复发或转移则给予放、化疗,中位随访期3年.
    2.RNA的抽提和逆转录:(1)石蜡切片RNA抽提:石蜡切片样品刮人1.5ml离心管加人1ml甲苯及无水乙醇,振荡离心,无水乙醇重复洗涤离心,37℃十燥10一15min加人1mlRNAiso,研磨粉碎,转人1.5nil离心管,静置5min.按RNAiso1/5体积加人氯仿,震荡离心,加人异丙醇,混匀静置离心,75%乙醇洗涤沉淀离心,室温干燥5min.用50闪DEPC水溶解沉淀,紫外分光光度计测量RNA浓度(2)逆转录:加6一随机引物2闪,70℃变性5min加人5x缓冲液4闪,dNTP1闪、RNase0.5闪、逆转录酶0.3闪的混合液_反应条件:37℃60min,700C15min,4℃保存.
    3.FQ-PCR:LUNX引物序列为:上游:5'-_}TTCCT-GGCCTGAACAACATC-3',下游:5'-AGGGGCGTAT-TCACTTGGAG-3’内参甘油醛一3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列:上游:5'-GCCACATCGCTCAGA-CACC-3',下游:5'-G-ATGGCAAC:AATATCCACTT-TACO-3'.定量PCR反应体系:SIBRGreen10浏、ROX0.4闪、引物(F,R)1闪,cDNA2闪反应条件:950C5min预变性,95℃30s,60℃30、,共37个循环,72℃退火10min采用FQ-PCR仪ABI一步法检测,计算所有样本及内参照的Ct值,通过比较Ct法取得相对定量的结果_4统计学方法:应用SPSS19.0统计软件分析,组间率的比较采用丫检验,用Log-rank进行差异检验,采用Kaplan-Meier法(K-'VI法)估计生存率及平均生存时间,绘制生存曲线.
    结果
    LUNXmRNA在所有肺癌组织均有表达(160/160),在10例肺良性疾病患者淋巴结均未见表达(0/10),N:淋巴结160枚中有17枚表达(17/160),其中鳞癌有2枚表达(2/59),腺癌有15枚表达(15/101),腺癌患者中N:淋巴结中LUNXmRNA表达高于鳞癌(P<0.05);IA期患者有4枚表达(4/82),IB期患者有13枚表达(13/78),IB期患者N}淋巴结I,UNXmI}NA表达高于IA期(P<0.05,表1);生存分析显示N:淋巴结表达患者5年生存率较不表达患者明显降低(P<0.O1,图1).
    讨论
    即使对于完全切除的I期NSCLC复发率仍然达25rig一50,可能的原因就是常规检查不能检测到的微转移1_LN\是一个人类肺组织特异性基因_本研究中,LL一NXmRN-1在肺癌组织中均有表达,在良性疾病患者淋巴结中均未见表达,表明其特异性较高.
    本组中腺癌患者N,淋巴结中LCNXmRNA的表达明显高于鳞癌,说明I期腺癌患者更容易发生纵隔淋巴结微转移_本研究中IB期患者Nz淋巴结LUNXmRNA表达明显高于IA期,说明IB期患者较IA期发生NZ淋巴结微转移可能性更大非小细胞肺癌的治疗及预后主要由肿瘤的TNM分期决定,其中N,淋巴结有无转移更是区别局限性肺癌和局部晚期肺癌的重要决定因素,也是预后不良的重要标志研究认为淋巴结微转移可导致患者不良预后}i本研究结果显示,Nz淋巴结中检测到LUNXrnRNA的表达,提示即使早期肺癌亦有可能发生纵隔淋巴结微转移,且生存分析显示’Nz淋巴结中LUNXmRNA表达患者5年生存率较不表达患者明显降低,成为影响预后的重要因素之一本研究结果表明,I期NSCLC患者Nz淋巴结中LUNXmRNA表达提示可能存在微转移,且预后较差,可以作为患者预后独立影响因子并可以作为NSCLC患者术后综合治疗(放、化疗)、判断治疗效果等较好的参考指标.腺癌N,淋巴结微转移率可能高于鳞癌,提示预后较鳞癌差.I}期患者预后较IA期差可能与其N:淋巴结微转移率较高有关.
    参考文献
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