腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2和骨形态发生蛋白-7基因联合转染大鼠脂肪来源干细胞对成骨分化的影响

骨形成蛋白或骨形态发生蛋白(BMPs)是目前所 知的唯一可诱导异位骨形成的蛋白家族,属于转化生长因子一(3(TGF-(3)超家族成员之一.人们已经发现了20种以上的BMPs成员,其中BMP-2和BMP-7有良好的成骨活性,也是研究较多的具有成骨能力的细胞因子[23〕.BMP-2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的非常重要的细胞外信号分子,而BMP-7具有强大的异位成骨能力,对其他各种成骨因子有协同作用.
    目前干细胞治疗一直是再生医学研究热点之一. 机体自身存在多种干细胞,脂肪来源干细胞(ADSCs)是其中很重要的一种,它具有一定的多向分化能力,而且ADSC,具有获取容易且量大、容易培养、扩增能力强等优势,使其在组织工程领域具有良好的应用前景.通过将ADSCs作为受体,为实现2个基因的稳定长期表达,我们利用重组腺病毒将BMP-2和BMP-7联合转染到ADSCs中,检测联合作用下干细胞向成骨分化的能力.
    材料和方法
    1.材料:限制性核酸内切酶BamHI,EcoRV,XbaI,NheI,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶(Promega公司)限制性核酸内切酶PI-SceI、I-CeuI(Clontech公司)脂质体Lipofectamine(Gibco公司)pShuttleVector,Adeno-XViralDNA、大肠杆菌DHSa,293细胞(Clontech公司)ALP检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)SD大鼠由第三军医大学动物中心提供.
    2.BMP-2,BMP-7重组腺病毒表达载体的构建:根据序列信息,分别设计1对BMP-2和BMP-7的聚合酶链反应(PCR)引物,扩增得到BMP-2和BMP-7的ORF}BMP-2的上游引物为5'-TTAGGATCCATGGTG-GCCGG-3',下游引物为5'-'rTA(}AT_1TCCT:}GCC}ACA-CCCACAACCCT-3';BMP-7的上游引物为s'-}rrrcc,A-TCCATCACGTGCG-3',下游引物为5'-GGCG_aT1TCC-TAGTGGCAGCCACAG-3'.将PCR片段分别连接到pcDNA3.1载体上pcDNA3.I一BMP-2,pcDNA3.1一BMP-7和载体pShuttle分fl}!用XbaI和NheI双酶切,回收后将DNA片段分别和载体片段连接,得到pShuttle-BMP-2和pShnttle-RMP-7用PI-ScPLI-CPUI双酶切酚/氯仿/异戊醇法提纯酶切片段,酶切片段分别与携带绿色荧光和携带红色荧光腺病毒载体(Adeno-XViralDNA)连接.
    3.ADSC、的分离和培养:SD大鼠麻醉成功后,取腹股沟直切日,切取皮下脂肪称重后移人超净台,用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,去包膜、结缔组织和血管后将脂肪捣碎,加人0.1%的I型胶原酶,加人量为组织3倍体积,37℃搅拌60一90min使消化完全.用含有10%的胎牛血清(FBS)和1%的双抗的DMEM重悬,吸管轻轻的吹打重悬液,将液体移人新的离心管中,1200r/min离心10min.吸出上层脂肪及上清液,再用上述DMEM重悬细胞,200目筛网过滤,最后补足细胞培养液铺于培养皿,置于370C,5%COZ的孵育箱培养.48h后首次换液,以PBS冲洗3次,使用DMEM成骨条件培养液继续培养,以后每2一3d换液1次细胞生长汇合80%时,0.OS胰蛋白酶+0.O1%乙二胺四乙酸(EDTA)消化,进行细胞传代,计数后分到另一培养皿继续培养扩增传至2代细胞4.Ad-BMP-2,Ad-BMP一腺病毒的包装:酚/氯仿/异戊醇法提纯PacI酶切后的线性化Ad-BMP-2和Ad-BMR7.将293细胞以5x10'/L接种于6孔板,待细胞长到60%一70%时,按Invitrogen公司的Lipo-fectamine2000转染手册进行转染.7一lOd后,反复冻融细胞,收集上清液重新感染293细胞,大量扩增病毛手.
    5.Ad-BMP-2,Ad-BMP-7对ADSCs联合转染:分离培养到的ADSCs传至第3代,在细胞80%融合的时候进行病毒转染.将获得的病毒Ad-BMP-2转染ADSCs,Ad一BMP-7转染ADSCs和Ad-BMP-2,Ad一BMP-7共转染ADSCs,另设未转染组ADSCs作为对照.培养12h后更换新鲜培养液,每2d换液,第10天将细胞置于荧光显微镜下观察.
    6成骨相关蛋白的检测:转染腺病毒第14天,用westernblot法检测各组细胞的I型胶原(CollagenI)和骨钙素(OCN)的蛋白表达.
    7.碱性磷酸酶(ALP)活性检测:转染14d后,裂 解细胞,采用ALP试剂盒测定细胞裂解液的ALP浓度8.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析,采用AVONA过程进行单因素方差分析.
    结果
    1.腺病毒Ad-BMP-2和Ad-BMP-7重组质粒的鉴定:PCR鉴定结果表明,重组的腺病毒含有BMP-2(1296by歹和BMP-7(1191by)基因的全长(图1).
    2.荧光显微镜观察:腺病毒转染ADSCs后第10天,荧光显微镜下发现BMP-2腺病毒转染组出现绿色荧光蛋白表达,BMP-7腺病毒转染组出现红色荧光蛋白表达;而BMP-2和BMP-7腺病毒共转染组则表现出黄色的荧光,表明BMP-2和BMP-7实现了高效稳定表达.
    3.成骨相关蛋白的检测:实验共分4组,分别为对照组、Ad-BMP-2组、Ad-BMP-7组以及联合转染组.分别检测每组中CollagenI和OCN的蛋白表达.结果如图2所示,Ad-BMP-2组、Ad-BMP一组的CollagenI和OCN蛋白表达量明显高于对照组,Ad-BMP-2和Ad-BMP-7联合转染组CollagenI和OCN蛋白表达量又明显高于单独转染组,说明了BMP-2与BMP-7的联合转染促进了干细胞向成骨细胞的分化〕4.ALP活性的检测:Ad-BMP-2和:Ad-BMP-7转染ADSCs后,ALP活性检测结果表明,Ad-BMP-2和Ad-BMP-7组ALP活性明显高于对照组(P<0.01),Ad-BMP-2和Ad-BMP-7联合转染组的ALP活性显著高于其他各组(P<0.01,图3).
    讨论
    BMP有近20个亚型,具有诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向分化、进而促进成新骨生成的能力,在骨折和骨缺损的修复过程中发挥重要作用[s-sBMP-2因具有较强的成骨能力,一直以来都被认为是最具有前途的骨诱导物质BMP}-7是最早确定的具有成骨诱导特性的BMP,在体外诱骨活性主要表现在靶细胞的成骨表型的变化上,持续接受BMP-7的刺激将大大加速骨缺损局部的成骨过程9]
    单纯使用这2个细胞因子于机体内,因机体的降解、稀释作用以及其本身在机体内半衰期过短等因素的限制,很难有效的发挥它们的作用.所以目前常常将这些细胞因子与载体复合.我们选用腺病毒为载体,把外源基因转染到细胞后,转染效率高,能较长时间稳定的表达外源基因.并且,腺病毒载体的DNA不与宿主细胞基因组整合,表达目的基因一段时间后不会对机体有什么影响,可以应用于各种疾病的基因治疗.将BMP-2基因重组到携带绿色荧光的腺病毒载体,并将BMP-7基因重组到携带红色荧光的腺病毒载体可以在荧光显微镜下直接观察到它们在细胞中的表达效率及检测表达时间,结果显示BMP-2和BMP-7在细胞内长时间高效表达.
    通过腺病毒载体系统联合基因修饰种子细胞ADSCs,使目标细胞可稳定、高效和较长时间共表达BMP-2和BMP-7基因.同时通过与对照组比较,其他3组腺病毒转染组的CollagenI和OCN的蛋白表达水平明显升高,其中BMP-2和BMP-7联合转染组CollagenI和OCN的蛋白表达水平升高更明显,说明利用BMP-2和BMP-7联合转染可大大增强ADSCs体外的成骨活性.ALP是参与骨代谢的重要蛋白和成骨细胞分化的早期标志,与其他组比较BMP-2和BMP-7联合转染组的ALP活性更高,进一步说明联合转染ADSCs后更有利于成骨细胞生长、分化.
    ADSCs来源丰富、取材简便,并具有稳定生长、繁殖和多向分化潜能,与其他的干细胞比较具有显著的优越性,在不同诱导条件下,ADSCs可以分别分化为脂肪细胞和成骨细胞.
    参考文献
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