慢病毒介导小干扰RNA沉默人结肠癌HT-29细胞芳香烃受体核转位蛋白基因的研究

我们应用RNA干扰技术敲低水通道蛋白(AQP)-5表达，观察对结肠癌肿瘤细胞体外药敏性及多药耐药性(MDR)因子的影响。
　　一、材料和方法
　　1.材料:窿哇蓝(MTT，美国Sigma公司;荧光定量逆转录一聚合酶链反应(FQ-PCR)试齐}J盒，美国Promega公司;抗体均为美国SantaCruz公司产品。
　　2.AQP-5小干扰RNA(siRNA)转染:参照文献[1」设计AQP-S-siRNA及对照NS-siRNA序列。HT-29细胞购自中国科学院上海细胞所，按说明书进行转染。
　　3.MTT试验:HT-29细胞接种于%孔板，加人MTT20},1培养4h，加人二甲基亚矾(DMSO)150w1，于490nm波长测吸光度(A)值。
　　4.RNA提取及荧光定量FQ-PCR;
　　Trizol一步法提取细胞RNA并进行逆转录及荧光定量PCR反应。引物序列为:P一糖蛋白(P-gp)上游:5-GTGGGGCAAG-TCAGTTCATT-3'，下游:5-TCTTCACC-TCCAGGCTCAGT-3'。谷肤甘肤S转移酶一二(GST一二)f=游:5一GGAGACCTCACC-CTGT_}CCA-3，下游:5-GGCTaGGACCT-CATGGATCA-3拓扑异构酶(Topo})上游:5'-CAGGTGGTCGTAATGGTTATG-3，下游:5-'ITrGGACAGATCTGGTTG-GA-3胸昔酸合成酶(TS)上游:5'-AG_CAACCCTGACG-ACAG.4AG-3，下游:5-CATG"rCTCCCGATCTCTGGT-3。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游:5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，下游5-GCTI'CACCACCTTCTTGATGTC-3。
　　5.Westernblot检测:提取细胞总蛋白，经聚丙烯酞胺凝胶电泳分离、电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分别以P-gpGS'I'一二、TopoII,TS一抗孵育，化学发光法显色。
　　6.统计学方法:数据以均数*标准差表示，应用SPSS11.5统计软件分析，采用ANOVA分析和t检验。
　　二、结果
　　1.AQP-S-siRNA对AQP-5表达的影响:与NS-siRNA组比较，转染AQP-S-siRNA可明显抑制HT-29细胞AQP-5的表达(P>0.O5)。
　　2.转染AQP-S-siRNA对HT-29细胞增殖的影响:与NS-siRNA组细胞比较，AQP-S-siRNA组细胞增殖活性明显降低(P<0.05)。
　　3.AQP-S-siRNA对耐药基因表达的影响:与NS-siRNA组比较，AQP-S-siRNA组MDRI/Y-gp,GST一二、TopoII的表达水平下降(P<0.05),TS表达变化不明显(P>0.O5)。
　　三、讨论
　　本研究结果显示，结肠癌细胞中AQP-5表达增强，AQP-S-siRNA作用于HT-29细胞后，其增殖明显受到抑制，提示AQP-5与结肠癌关系密切。我们检测了siRNA转染前后肿瘤细胞MDR因子MDRI/P-gp,GST-"rr,Topo}和TS的变化，结果可见敲低AQP-5后P-gp,GST,TopoI[的表达均受到抑制，TS的表达水平变化不明显。本研究结果提示，AQP-5通过影响部分耐药因子的表达在MDR形成途径中发挥作用。
　　参考文献
　　Heddleston JM,Li Z,Lathia JD. Hypoxia inducible factors in cancer stem cells[J].British Journal of Cancer,2010.789-795.
　　吴星烨,傅仲学,王学虎. 缺氧诱导因子-1抵抗缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡[J].中华实验外科杂志,2010,(2):213-215.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.02.026.