肝移植术后γδT细胞及其亚群的特征及临床意义

　　肝移植已成为终末期肝病最有效的治疗有段，尽管各类免疫抑制剂(环抱菌素,FK506,麦考酚醋等)的有效应用，但急性免疫排斥仍然是移植物功能丧失的宇要原因之一随着免疫学的发展，参与肝移植术后免疫反应的细胞被不断发现。过去Thl/Th2的动态平衡理论，不能完全解释急性排斥反应发生的原因。后来发现自然杀伤细胞(NK细胞)、树突状细胞(DG),Th17细胞、调节性T细胞(Treg)等都可能参与了肝移植术后的免疫调节。
　　近年来，在白身免疫病、病毒性感染和恶性肿瘤中备受关注的γδT细胞亚群数量变化被认为与肝移植术后自发性免疫耐受的产生有重要联系，但在肝移植术后急性排斥方面尚无明确报道。本研究观察肝移植术后发生急性排斥反应的患者外周血中泌T细胞及其γδT,Vs2亚群的变化特征，为进一步阐明排斥反应的发生机制提供依据。
　　1对象和方法
　　1.1研究对象选择2011年7月至2012,年6月解放军302医院肝移植研究中心收治的肝移植术后患者27例，其中急排组为观察期内发生急性排斤反应(以病理学诊断为主)的患者11例，男女比为10/1，平均年龄为(52士9)岁;稳定组(即非急排组)为观察期内没有发生过急性排斥反应且肝功能保持正常的患者16例，男女比14/2，平均年龄为(5419)岁，两组患者在肝移植术后均以糖皮质激素、F1}506、环袍素A、硫哩嚓吟应用为主。选择年龄匹配的健康志愿者12例为对照组，男女比为10/2,所有受试者均签订知情同意书。入选者于清晨采集肝素锉抗凝的空腹静脉血.
　　1.2方法本实验为回顾性研究，收人的急排组患者均在肝移植术后5个月左右发生急性排斥，急排组采血点为取得病理学诊断后2一3d之内;稳定组采血点同在术后5个月左右。取200闪全血，依次加人荧光标记抗体:PerCP一anti一CD3(BD公司)，FITC。n-ti一γδT(Thereto公司),PF一anti一Vs2(Biolegend公司)各3闪，避光染色20min，加人10倍稀释的溶血素(RDFAGSLysingSolution)2ml，室温避光孵育5min,洗涤后4%多聚甲醛150浏固定，4℃保存，24h内上机测定。采用美国BD公司F'ACSCalibur流式细胞仪Cellquest软件检测，FlowJo软件分析，γδTan,γδTo,Vs2%为占CD3细胞的百分率1.3统计学分析实验结果应用SPSS16.0统计软件进行统计分析，实验数据以中位数(最小值，最大值)表示，多组间比较采用Kruskal一ailsH检验，两组间比较采用NemenS=i检验，显著性检验标准为双侧P<0.05;相关性采用Spearman检验，P<0.O1为差异有统计学意义2结果应用流式细胞仪检测三组患者γδT,VS2亚群的频率见图1}γδT亚群频率变化:三组间比较差异有统计学意义(H=11.974,P<0.05)，稳定组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但两组均高于急排组(P<0.05);VS2亚群频率变化:万组间比较差异有统计学意义(H=11.603,P<0.051，急排组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但两组均高于稳定组(P<0.O5);泌T细胞频率变化:三组间无明显统计学差异(H-2.801,P>0.O5);V81/V82值:三组间比较差异有统计学意义(H=14.839,P<0.05)，急排B组与对一照组差异无统计学意义(P>0.05)，两组均低于稳定组(P<0.O5)(表1)。
　　检测急排组和稳定组患者的FK506血药浓度，两组差异无统计一学意义(P>0.05)另外，检测患者的各项肝功能临床指标.V8l/V82与AT.T,AST,ALP,GGT呈明显的线性负相关(图2)。
　　3讨论
　　γδT细胞是一群非经典的淋巴细胞，主要分为V81,V82两种亚群，V82亚群主要表达穿孔素及杀伤受体IVKG2C,KLRFl，识别细菌表面非肤类抗原，作为天然免疫细胞，发挥杀伤功能;Vs1T亚群分布在肠道、皮肤、脾脏和肝脏，限制炎症及病理损伤。健康成年人外周血中，Vsz是γδT细胞的主要亚群，所占比例多于70%。γδT细胞早期在鼠的肝移植模型中观察到作为调节细胞维持小鼠的免疫耐受，在后期的临床研究中报道参与同种异体骨髓移植和肾移植术后的免疫调节。
　　肝脏是一个免疫特惠器官，z0ClG的移植受者可发生自发性免疫耐受，甚至可以停用免疫抑制药物最近的两个研究发现，与健康人不同，肝移植术后发生免疫耐受的患者}Ts}群明显扩增，成为γδT细胞的主要亚群.。这些结果提示，肝移植术后患者的外周血中VsTT细胞可能发挥移植物保护的免疫调节作用，并g_γδT,VS2两亚群的比例有可能成为鉴定肝移植术后患者可否停止免疫抑制治疗的指标之一1ui一Pev等也发现，肝移植或是肾移植术后接受或不接受免疫抑制药物治疗，γδT群都显著扩增，γδT,VS2比例倒置，此外，他们还发现肝移植耐受患者中F}CV或巨细胞病毒}c}IV)阳性组对比阴性组，γδT群扩增.vsz群明显减少，因此他们认为γδT细胞及其亚群的变化是病毒感染导致，但是他们不能解释肝移植术后需继续免疫抑制治疗的患者γδT细胞及其亚群发生变化的原因，而其他病毒单纯疙疹病毒(HSV),EB病毒(ARV>
　　并无此类相关性。此外，Vlalome等,=发现大鼠肝移植模型中发生急性排斥反应时γδT细胞频率明显卜升，但并没有对其亚群进行分析本研究结果显示:急排组、稳定组及对照组三组间yS.h细胞百分比无明显差异;发挥杀伤功能的vsz群，急排组显著高于稳定组;而VsTT细胞百分比，急排组显著低于稳定组，即发生急性排斥时Vs1T细胞大量减少，提示γδT亚群可能参与移植物的免疫保护Nagaeva等’7报道Vs1T细胞能产生白细胞介素(TI)一]10和转化生长因子(TGF)日参与母体对胎儿的免疫耐受.由此，我们认为可能在肝移植术后大量扩增的VsTT细胞类似Thz细胞，能够产生TT一10和TGF日等细胞因子，导致对移植物免疫耐受的发生.当VsTT细胞减少时，免疫耐受降低从而发生急性排斥反应。另外，急排组对比稳定组γδT/VS2显著降低，γδT/VS2值与肝脏损伤指标之间呈线性负相关，说明肝移植术后γδT/VSz值越高肝脏损伤程度越低。因此，γδT/VS2可能成为预测肝移植术后急性排斥反应发生的免疫学指标。
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