N甲基D天冬氨酸受体2B基因（GRIN2B）启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病的相关性分析

　　作者：江汉秋,张晓君,刘瑾,马中华,贾建平　　作者单位：首都医科大学附属北京同仁医院神经内科，北京

　　【摘要】目的 探讨中国北方汉族人群N甲基D天冬氨酸受体2B(NmethylDaspartate receptor 2B，NR2B)基因GRIN2B启动子区变异与散发性阿尔茨海默病(sporadic Alzheimer′s disease，SAD)的关系。方法 利用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的方法对中国北方汉族362例SAD患者和334名正常对照者进行GRIN2B启动子多态性及载脂蛋白E(ApoE)分型。结果 中国北方汉族人群中GRIN2B 启动子区存在-200T/G(rs1019385)、-421C/A(rs3764028)、-1447T/C(ENS10557853)和-1497G/A(rs12368476)多态性位点;-421C/A多态性在SAD和正常对照组中的基因型频率(P=0.029)和等位基因频率(P=0.010)差异显著;不携带ApoE ε4的人群中-421C/A多态性的基因型频率(P=0.012)及等位基因频率(P=0.004)差异亦显著;所发现的4个多态性位点之间存在连锁不平衡关系，但其单体型分布在AD组和正常对照组中差异不显著。结论 -421C/A多态性与AD发病有明显的相关性，在ApoE ε4阴性的人群中这种相关性更为明显，-421C/A多态性可能独立于ApoE ε4而影响SAD发病。

　　【关键词】 阿尔茨海默病,N甲基D天冬氨酸受体2B基因,启动子;多态性

　　【Abstract】 Objective To study the association between promoter variations of NmethylDaspartate receptor 2B (NR2B) subunit gene (GRIN2B) and sporadic Alzheimer′s disease (SAD) in Chinese Han population.Methods All GRIN2B promoter and ApoE polymorphisms of 362 SAD patients and 334 healthy controls in the North Chinese Han population were genotyped by PCRrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) using emzyme digestion.Results The proximal promoter of GRIN2B had four polymorphisms detected by sequencing，which were 200T/G (rs1019385)，421C/A (rs3764028)，1447T/C (ENS10557853)，and 1497G/A (rs12368476).There were significant differences in genotype and allele frequencies for 421C/A between SAD and control (genotype P= 0.029，allele P= 0.010).In the subjects without ApoE ε4 allele，these differences remained significance (genotype P=0.012，allele P=0.004).The linkage disequilibrium was presented among the four SNPs.All haplotypes had no significant difference between SAD and control.Conclusions The 421C/A is significantly associated with AD susceptibility，even in negative ApoE ε4 cases.The 421C/A could increase the risk for AD independent of ApoE ε4.

　　【Key words】 Alzheimer′s disease;GRIN2B;Promoter;Polymorphisms

　　位于突触后膜的N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型，其功能主要是参与学习和记忆活动，并介导兴奋性神经损伤〔1，2〕。NMDA受体具有两面性，在生理作用下它是神经发育、突触可塑性等必不可少的物质，在病理作用下它又可发挥其毒性作用。N甲基D天冬氨酸受体2B(NmethylDaspartate receptor 2B，NR2B)亚基是NMDA受体的重要功能单位，其结构中包含谷氨酸与NMDA受体结合的位点〔3〕。NR2B被认为是NMDA受体发挥药理学、电生理学及行为学作用的主要亚基。目前，关于NR2B基因GRIN2B变异与阿尔茨海默病(AD)之间的相互关系引起一些学者的关注，但尚未得到阳性结果〔4，5〕。本研究是国内外首次在中国北方汉族人群中对GRIN2B启动子区进行的筛查研究。根据NR2B在AD发病中所起的作用，预筛查中国北方汉族人群GRIN2B基因近似启动子区的变异位点，并通过遗传学角度阐述其与散发性AD(SAD)发病的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 2000～2007年来自首都医科大学宣武医院、北京市老年病医院、北京市十余家老人院的SAD患者362例，男165例，女197例，年龄60～79〔平均(70.4±6.8)〕岁。所有患者均进行简易精神状态量表(MMSE)评分和Hachinski缺血评分。采用美国国立神经病、语言功能紊乱和脑卒中研究所及AD和相关疾病协会(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer′s Disease and Related Disorders Association，NINCDSADRDA)临床诊断标准，把诊断为“很可能AD”的患者列为研究对象。2000～2007年宣武医院门诊及秦皇岛海港区退休健康老年体检者334例为对照组，男142例，女192例，年龄60～75〔平均(68.4±8.1)〕岁，且均经MMSE评分、Hachinski缺血评分和门诊系统体检证实为健康人。

　　1.2 基因组DNA提取 采集清晨空腹外周静脉血5 ml，枸椽酸钠抗凝，常规酚氯仿抽提法提取基因组DNA。

　　1.3 GRIN2B启动子区变异位点筛查

　　1.3.1 引物设计 根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)及Miyatake等研究〔6〕中提供的资料，在GRIN2B 近似启动子区用Primer Premier 5设计引物(表1)。

　　1.3.2 PCR扩增 随机选取25例SAD患者和25名正常对照者的DNA标本，用标准PCR方法扩增GRIN2B基因近似启动子区，其位于相对转录起始点(transcription start site，TSS)1 621 bp至+177 bp区域。PCR反应体系：DDH2O 9.6 μl，2×缓冲液 12.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.8 μl，上、下游引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，LA Taq酶(5 U/μl)0.1 μl，DNA模板1.0 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min 50 s，共30个循环，72℃再延伸7 min。

　　1.3.3 直接测序 用直接测序的方法系统筛查GRIN2B 启动子区变异位点(共1 798 bp)。

　　1.4 多态性分型

　　1.4.1 引物设计 用Primer Premier 5设计引物，分别扩增各相应片段(表1)。

　　表1 GRIN2B启动子区多态性筛查所需引物及PCR产物片段长度(略)

　　1.4.2 PCR扩增 对所有样本均进行相应片段的PCR扩增。PCR反应体系均为：DDH2O 10.0 μl，2×缓冲液 12.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，上、下游引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，LA Taq酶(5 U/μl)0.1 μl，DNA模板1.0 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，55/54/49℃ 30 s(200T/G位点为55℃，421C/A、1447T/C位点均为54℃，1497G/A位点为49℃)，72℃ 30 s，共35个循环，72℃再延伸5 min。

　　1.4.3 GRIN2B启动子区多态性限制性内切酶消化和电泳条件 见表2。

　　1.5 统计学处理 通过SHEsis检测每组各多态性的分布是否符合HardyWeinberg(HW)平衡(http://analysis.biox.cn/myAnalysis.php)〔7〕。等位基因和基因型频率在患者和对照组中的分布差别均用SPSS13.0统计软件包进行χ2检验。与疾病的关联强度用比值比(Odds Ratio,OR)和95%可信区间(95% CI)表示。用Logistic回归校正年龄、性别和ApoE状态。连锁不平衡分析、单体型频率及与疾病的关联强度的分析同时在(http://analysis.biox.cn/myAnalysis.php)〔7〕中进行。

　　表2 GRIN2B启动子区多态性限制性内切酶消化片段长度及电泳条件(略)

　　2 结果

　　2.1 GRIN2B启动子区变异位点筛查 25名SAD患者和25名正常对照者的GRIN2B 启动子区1 798 bp片段的直接测序发现，中国北方汉族人群中GRIN2B 启动子区存在4个多态性位点，分别为200T/G(rs1019385)、421C/A(rs3764028)、1447T/C(ENS10557853)和1497G/A(rs12368476)。

　　2.2 GRIN2B启动子区多态性位点的遗传学分析 见表3。每个多态性位点在人群中的基因型和等位基因分布均符合HW平衡。只有421C/A多态性位点的基因型频率和等位基因频率在SAD和正常对照组中有显著差异(P<0.05)。在不携带ApoE ε4的人群中，421C/A多态性位点的基因型及等位基因频率在SAD和正常对照组也存在显著差异(P<0.05)。然而在携带ApoE ε4的人群中，分布却没有不同。这表明，421C/A多态性可能是独立于ApoE ε4而影响SAD发病的。此外，Logistic回归(表4)还发现，421CC基因型可增加AD的发病风险，其风险大约是CA+AA基因型的1.5倍(OR=1.517，95% CI 1.077～2.137，P=0.017)。然而，200T/G、1447T/C和1497G/A多态性位点的基因型等位基因频率在AD组和对照组间均无显著差异，在携带与不携带ApoE ε4的亚组中也是如此(表3)。Logistic回归分析中，去除年龄、性别和ApoE ε4的影响，同样也不支持其与AD的发病有关。连锁不平衡分析发现，在200T/G、421C/A 和1497G/A 这3个多态性位点间存在较明显的连锁关系，这种连锁关系即使是在经过ApoE ε4分层之后也存在(D′>0.7，r2 >0.5)。单体型分析发现，只有4种单体型即TCTG、GACA、TCCG和GATA在本研究的人群中频率超过3%，且在AD组和正常对照组中其分布无显著差异。在经过ApoE ε4分层之后，虽然又有TATA单体型频率超过了3%，但在AD和正常人的分布差异亦不显著。

　　表3 各多态性位点基因型及等位基因在AD与正常人中的分布(略)

　　表4 各多态性与AD疾病危险度的相关分析(略)

　　3 讨论

　　目前关于NR2B基因GRIN2B变异与相关疾病的研究主要集中在编码区和3′非编码区(untranslation region，3′UTR)上，关于GRIN2B启动子区变异与疾病关系的研究较少。GRIN2B变异与AD之间的相互关系已逐步引起一些学者的关注，其中包括了编码区外显子13的2664T/C位点〔4，5〕、3′UTR的5073G/T位点〔5〕及启动子区的200T/G位点〔5〕，然而以上研究的单一位点分析均尚未得到阳性结果。

　　在本研究中，本研究筛查了中国北方汉族人群GRIN2B近似启动子区基因多态性，共发现了4个多态性位点。遗传学分析发现，421C/A多态性与AD的发病有明显的相关性，421C等位基因在AD中的分布明显高于正常人。在ApoE ε4阴性的人群中，421C/A多态性与SAD的发病的相关性更为明显。由此可见，421C/A多态性可能是独立于ApoE ε4而影响SAD发病的，而且421CC基因型可增加AD的发病风险，其风险大约是CA+AA基因型的1.5倍。然而，200T/G、1447T/C和1497G/A多态性位点的基因型和等位基因分布均与AD的发病没有明显的相关性，在经过ApoE ε4分层之后也是如此。

　　目前，国内外学者关于GRIN2B启动子区变异与疾病(如：精神分裂症、亨廷顿舞蹈病、酒精中毒等)相关性的研究主要集中在200T/G位点上〔8～10〕，尚无启动子区其他位点与任何疾病的相关报道。本研究发现了421C/A(rs3764028)与SAD的相关性。到目前为止，只有Seripa等人〔5〕对GRIN2B启动子区多态性位点与SAD的发病关系进行了研究，且只研究了200T/G这一个启动子区多态性位点，结果表明在高加索人群中，该多态性位点与SAD的发病不相关，本文中200T/G位点研究结果与之相一致。

　　本研究发现，既往的研究虽然单一位点的阴性结果较多，但经过连锁不平衡及单体型分析后，有些还可找到对疾病有危险或保护作用的单体型〔8，10〕。在Seripa等人〔5〕的研究中，还证实了启动子区的200T/G与2664T/C和5073G/T存在明显的连锁不平衡，且GCT单体型可能增加了SAD的发病风险(OR=1.690，95% CI 1.068～2.674)。为此，本研究也对发现的4个多态性位点进行了连锁不平衡分析及单体型频率的统计，虽然这4个多态性位点存在一定的连锁不平衡关系，然而频率>3%的单体型分布在SAD和正常人中并没有显著差异，即使是在进行了APOE分层之后结果也是如此。需要在今后的研究工作中进一步扩大样本量或者另外去探寻中国北方汉族人群编码区或3′UTR的多态性位点，才有可能发现有意义的单体型，从而明确GRIN2B基因变异在SAD发病中的作用。

　　总之，GRIN2B启动子区421C/A多态性与AD发病明显相关，C等位基因可能增加了AD的发病风险，但其复杂的机制还有待于进一步的功能学研究。

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