Axin蛋白表达与肝细胞癌发生及预后关系的研究

　　作者：董承伟,曾勇,丁怡,庄冠一,李森　　作者单位：1潍坊市人民医院　肝胆外科　(山东　潍坊)　2四川大学华西医院　普外科　(四川　成都) 3 潍坊医学院　病理生理学教研室　(山东　潍坊)

　　【摘要】目的：明确Axin蛋白在正常肝组织、肝细胞癌组织、癌旁组织中的表达，探讨Axin蛋白表达与肝细胞癌的发生及与预后影响因素间的关系。方法：采用免疫组织化学方法(SABC法)检测正常肝组织(15例)、肝细胞癌组织(40例)及其癌旁组织(21例)中Axin蛋白的表达及定位。结果：正常肝组织、肝细胞癌组织及癌旁组织中均有Axin蛋白表达，其阳性表达率分别为92.9%、57.5%和90.5%。Axin蛋白表达于阳性细胞胞质中;正常肝组织与癌旁组织中Axin蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05);正常肝组织和癌旁组织中Axin蛋白表达与癌组织比较，差异均有统计学意义(P<0.05);Axin的表达与肝细胞癌患者性别、年龄、肿瘤大小、AFP表达水平无关(P>0.05)，而与临床病理分期、门静脉癌栓形成相关(P<0.05)。结论：Axin蛋白表达减弱可能参与肝细胞癌的发生;Axin蛋白表达水平可作为肝细胞癌患者诊断和预后判断的一项指标。

　　【关键词】 癌，肝细胞•Axin蛋白•免疫组织化学

　　Expression of Axin correlates with genesis and prognosis of hepatocellular carcinoma

　　DONG Cheng-wei1, ZENG Yong2, DING Yi3, ZHUANG Guan-yi1， LI Sen1

　　1Department of Hepatobiliary Surgery，Weifang People’s Hospital (Weifang 261041，China)

　　2Department of General surgery，Huaxi Hospital of Sichuan University (Chengdu 610041，China)

　　3Department of Pathophysiolgy， Weifang Medical College (Weifang 261041，China)

　　【ABSTRACT】 Objective: To detect the expression and distribution of Axin in the normal liver tissue, paracarcinomatous tissue and primary hepatocellular carcinoma tissue and investigate the relationship between Axin expression and the genesis, and prognosisof HCC. Methods: The expression of Axin protein was evaluated in paraffin embedded tissues by immunohistochemical techniques (SABC) in 40 case of HCC, 21cases of paracarcinomatous tissue and 14 cases of normal liver tissue.And 5 case of normal stomach tissue and 5 cases of gastric carcinoma tissue were evaluated as a positive control. Results: The expression of Axin protein was observed in HCC tissues, paracarcinomatous tissues and normal liver tissues. The positive expressions of Axin were 57.5%、90.5%、92.9% respectively. The brown granules of positive cell were mainly distributed in the cytoplasm. No significant difference in the expression of Axin was found between normal liver tissues and paracarcinomatous tissue(P>0.05), but not between the paracarcinomatous tissue and HCC(P<0.05). Axin protein expression were not related to age, sex, tumor size and the expression of AFP, but were significantly correlated with portal vein invasion and clinical pathological stage. In normal stomach tissue, the expression of Axin is strong in the stem cells and weak in the mature cells. But its expression in normal liver tissue is well-proportioned. Conclusion： Axin expresses mainly in the stem-cells, and its expression is important to sustain the function of the stem-cell; Hepatitis B and liver cirrhosis have no influence to the expression of Axin;The reduced expression of Axin correlates with the genesis of HCC;The check of its expression can be used as an independently index to evaluate the biological behavior and prognosis of HCC.

　　【KEY WORDS】 Carcinoma, hepatocellular•Axin•Immunohistochemistry

　　肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上10种最常见癌症之一，同时也是人类最致命的恶性肿瘤之一，尽管近年来在HCC的诊断和治疗方面都取得了很大进步，但其5年生存率仍然比较低。作为Wnt信号传导途径的抑制性因子，Axin被认为是一个抑癌基因。现已发现多种肿瘤的发生与Axin基因异常表达有密切关系[1-5]，但蛋白水平表达的异常与HCC的发生及其临床病理特征关系方面的研究至今未见报道。本研究旨在进一步明确HCC发生、发展的分子机制，进而为HCC患者的临床治疗及预后判断提供指导。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　选取四川大学华西医院2004年8月—2005年2月手术切除的HCC标本40例，其中男35例，女5例，年龄15～70岁，平均年龄48.4岁。所有患者术前均未使用放疗或/和化疗。癌旁组织取自肿瘤边缘2～3 cm外肝组织。另外14例正常肝组织标本取自华西医科大学传染科实验室。

　　1.2　方法　所有组织10%中性甲醛固定，石蜡包埋。采用SABC免疫组织化学方法。兔抗人Axin(H-98)多克隆抗体为美国Santa Cruz Biotechnology公司生产，山羊抗兔SABC免疫组织化学试剂盒(SA1022)购自武汉博士德生物工程有限公司。切片常规脱蜡、水化后，采用微波炉进行抗原修复，严格按照试剂盒说明书操作，DAB显色。采用正常胃黏膜组织作为阳性对照，PBS液代替一抗作为阴性对照。

　　1.3　结果评判　Axin染色阳性信号为棕黄色，定位于细胞质内，背景清晰，间质无着色。根据细胞染色强度和染色细胞所占面积积分之和进行判定。染色强度积分：无染色为0分;轻度染色为1分;中度染色为2分;强染色为3分。染色面积积分：无细胞染色为0分，细胞染色<25%为1分;细胞染色25%～50%为2分;细胞染色>50%为3分。两项积分之和≥2为表达阳性，<2为表达阴性。

　　1.4　统计学处理　应用SPSS10.0软件进行分析，组间比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　Axin蛋白在正常肝组织、癌组织和癌旁组织细胞中的表达情况　免疫组织化学结果显示Axin蛋白主要分布在肝细胞胞质中，分布较均匀。Axin蛋白在正常肝组织中表达比较强;在HCC旁组织细胞(乙型肝炎、肝硬化者)中的表达稍弱;在正常胃黏膜(阳性对照)的基底部细胞中表达较强，而在其表面细胞中表达很弱，黏膜肌层细胞中则无表达(图1)。Axin蛋白在癌组织中的阳性表达率明显低于正常肝组织和癌旁组织，癌组织与癌旁组织中Axin蛋白阳性表达率的差异有统计学意义(表1)。

　　2.2　Axin蛋白的表达与HCC临床病理因素的关系　Axin蛋白的表达异常与HCC的门静脉癌栓形成、临床TNM分期相关，而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、包膜形成、AFP表达水平等无关(表2)。

　　3　讨论

　　大量研究发现Axin蛋白不仅对Wnt信号途径具有一定的抑制作用[6]，而且对JNK信号传导途径及p53蛋白有一定的激活作用[7-8]，还参与细胞凋亡的调节[8]，这提示Axin蛋白的异常表达可能与肿瘤的发生相关。以前的研究结果显示，Axin基因突变可以导致多种肿瘤的发生[1-5]，野生型Axin基因可导致多种肿瘤细胞的凋亡[2]，进一步表明Axin蛋白的表达异常可能与肿瘤发生密切相关。资料表明Axin蛋白的表达异常与某些肿瘤的临床病理学特征有一定的相关性[5]。

　　本研究采用免疫组织化学方法检测正常肝组织、HCC组织和癌旁组织肝细胞中Axin蛋白的表达情况，结果发现Axin蛋白在癌组织的阳性表达率明显低于正常肝组织和癌旁组织，提示Axin蛋白表达异常与HCC发生有关，由此推测各种致癌因素可能通过下调Axin基因的蛋白表达导致肿瘤细胞的过度增殖和/或凋亡减少。本研究还发现正常肝组织与癌旁组织(存在乙型肝炎病毒感染及肝硬化者)的阳性表达率差异无统计学意义，而乙型肝炎病毒感染及肝硬化者都是HCC的主要诱因，进一步说明Axin蛋白表达减少可能是导致HCC发生的重要途径之一，同时也提示Axin蛋白表达量的改变可以作为HCC诊断的一个指标。本研究结果显示，Axin基因表达异常与HCC的门静脉癌栓形成以及临床TNM分期有关，但是其表达水平与患者的性别、年龄、乙型肝炎肝硬化、肿瘤大小、AFP表达水平及是否存在包膜等无关，提示Axin蛋白可能与肿瘤的转移有关。推测Axin蛋白表达下调可以促进HCC的转移，从而影响患者预后，具体机制有待于进一步深入研究。

　　此外，本研究还发现Axin蛋白在正常胃黏膜的基底部细胞中表达较强，而在其表面细胞中表达很弱，黏膜肌层细胞中则无表达，提示Axin蛋白主要在具有一定分化、增生能力的干细胞中表达。已有研究表明Axin蛋白的表达对维持干细胞的稳定具有重要的意义，其过度表达可以促进干细胞的凋亡[9]，而表达减弱则可以诱导干细胞的过度增殖[10]。由此推测，Axin蛋白表达下调很可能与HCC的发生密切相关。

　　Axin蛋白的稳定表达对维持细胞的状态具有重要的意义，其表达异常可能是参与HCC发生的重要因素，其表达下调促进HCC的转移，影响患者预后。Axin蛋白表达与HCC的转移及临床分期相关，为临床诊断和判断HCC患者的预后增加了新的依据。

　　【参考文献】

　　[1] Webster MT, Rozycka M, Sara E,et al. Sequence variants of the axin gene in breast, colon, and other cancers: an analysis of mutations that interfere with GSK3 binding[J].Genes Chromosomes Cancer,2000 ,28(4):443-453.

　　[2] Satoh S, Daigo Y, Furukawa Y, et al. AXIN1 mutations in hepatocellular carcinomas, and growth suppression in cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1[J]. Nat Genet, 2000,24(3):245-250.

　　[3] Wu R, Zhai Y, Fearon ER,et al . Diverse mechanisms of beta-catenin deregulation in ovarian endometrioid adenocarcinomas[J]. Cancer Res,2001，61(22):8247-8245.

　　[4] Dahmen RP, Koch A, Denkhaus D, et al. Deletions of AXIN1, a component of the WNT/wingless pathway, in sporadic medulloblastomas[J]. Cancer Res. 2001,61(19):7039-7043.

　　[5] Nakajima M, Fukuchi M, Miyazaki T,et al. Reduced expression of Axin correlates with tumour progression of oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer. 2003 ,88(11):1734-17349.

　　[6] Ikeda S, Kishida S, Yamamoto H,et al. Axin, a negative regulator of the Wnt signaling pathway, forms a complex with GSK-3beta and beta-catenin and promotes GSK-3beta-dependent phosphorylation of beta-catenin[J]. EMBO J,1998,17(5):1371-1384.

　　[7] Rui Y, Xu Z, Lin S,et al. Axin stimulates p53 functions by activation of HIPK2 kinase through multimeric complex formation[J]. EMBO J,2004,23(23):4583-4594.

　　[8] Neo SY, Zhang Y, Yaw LP,et al. Axin-induced apoptosis depends on the extent of its JNK activation and its ability to down-regulate beta-catenin levels[J].Biochem Biophys Res Commun, 2000,272(1):144-150.

　　[9] Wei Hsu, Reena Shakya and Frank Costantini .Impaired mammary gland and lymphoid development caused by inducible expression of Axin in transgenic mice[J] . The Journal of Cell Biology, 2001,155(6): 1055-1064.

　　[10] Xiaoqing Song and Ting Xie .wingless signaling regulates the maintenance of ovarian somatic stem cells in Drosophila[J]. Development,2003,130(14):, 3259-3268 (2003).