改良GordonSweets染色在肝疾病诊断中的应用

　　作者：尹有群,王晓文,卢义生　　作者单位：东莞市人民医院，广东 东莞 523018

　　【摘要】目的：了解改良GordonSweets染色在肝炎、肝硬化诊断中的应用。方法：肝炎肝硬化的标本13例分别作改良GordonSweets、Masson与GordonSweets染色进行观察胶原纤维和网状纤维的分布。结果：改良GordonSweets染色能同时很好地显示网状纤维与胶原纤维，而且在偏光显微镜下能把胶原纤维分型。结论：改良GordonSweets染色能很好地把肝纤维化的情况显示出来。

　　【关键词】 肝炎;纤维化;特殊染色

　　在肝疾病的诊断中往往需要观察胶原纤维与网状纤维的分布,而在早期HE染色切片中，这些纤维通常不易和其他纤维蛋白鉴别，需要借助特殊染色，通常用Masson染色观察胶原纤维和GordonSweets染色观察网状纤维，但同时作这两种方法相当繁琐和费时，而且在肝疾病的诊断中只能辨别出这两种纤维是不够的，还要对胶原纤维进一步分型，改良的GordonSweets染色能很好地同时显示胶原纤维和网状纤维的分布并且把胶原纤维分型。

　　1 资料与方法

　　1.1 肝炎肝硬化的标本 13例各连续切片分别做改良GordonSweets、Masson和GordonSweets染色。

　　1.2 改良GordonSweets染色

　　1.2.1 试剂的配制 GordonSweets氏银铵液：用小量杯盛10%硝酸银水溶液2 ml，逐滴滴入氢氧化铵，边滴边摇动容器。先出现沉淀物，继续滴入氢氧化铵至所形成的沉淀物恰好溶解。最后加蒸馏水至40 ml，配好后用棕色砂塞瓶盛装，放于冰箱内保存，用前取出恢复到室温;0.25%高锰酸钾：高锰酸钾0.25 g，蒸馏水加至100 ml;2%草酸液：草酸2 g，蒸馏水加至100 ml;2%硫酸铁铵液：硫酸铁铵2 g，蒸馏水加至100 ml;10%中性甲醛液：浓甲醛液10 ml，蒸馏水90 ml，碳酸钙加至饱和，用时取其上清液;0.2%氯化金水溶液：氯化金2 g，蒸馏水加至100 ml;天狼猩红染色液：0.5%天狼猩红10 ml，苦味酸饱和液90 ml。

　　1.2.2 染色方法 切片脱蜡至水;用0.25%高锰酸钾氧化5 min，稍水洗;2%草酸漂白1 min～2 min，稍水洗;2%硫酸铁铵媒染5 min，稍水洗，再用蒸馏水洗一次;滴入GordonSweets氏银铵液作用1 min，蒸馏水稍洗;10%中性甲醛液还原约1 min，流水冲洗5 min，再用蒸馏水冲洗;0.2%氯化金调色1 min;5%硫代硫酸钠液固定，蒸馏水冲洗;置入0.5%苦味酸天狼猩红染液15 min～30 min;无水乙醇直接分化与脱水;二甲苯透明，中性树胶封固。

　　1.3 Masson染色与GordonSweets染色 两种染色大家都相当熟悉了，在此不再详述。

　　2 结果

　　改良GordonSweets染色所显示的网状纤维黑色，胶原纤维红色，与Masson染色所显示的胶原纤维蓝色的分布和GordonSweets染色所显示的网状纤维黑色的分布相符;若在偏光显微镜下还能观察到：I型胶原纤维紧密排列，显示很强的双折光性呈黄红色;II型胶原纤维有弱的双折光性呈红色或亮白色;Ⅲ型胶原纤维显示弱的双折光性呈绿色的细纤维;IV型胶原纤维呈浅黄色。

　　3 讨论

　　在慢性炎症，机化和瘢痕形成中，可随病理过程的发展而出现胶原纤维，正常肝组织间质的胶原在汇管区和小叶中央静脉周围，以Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原为主，Ⅴ型、Ⅵ型胶原较少，各成分的合成与降解处于动态平衡;在慢性纤维化过程中，各成分合成大于降解并在肝内沉积，其中以Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ为主，随着炎症的反复刺激，网状纤维增生，若肝小叶网状支架完整，从肝小叶周边区再生的肝细胞可沿支架延伸，不管肝细胞坏死范围大小，均能恢复正常结构，若肝小叶网状支架塌陷，网状纤维融合形成胶原纤维，或者由于肝细胞反复坏死及炎症刺激，纤维组织大量增生，形成肝小叶内间隔，此时再生肝细胞难以恢复原来肝小叶结构，肝硬化时肝小叶的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白明显增多，增多的胶原可沉着于小叶各处并伴有窦状隙内皮细胞的改变[1，2]。因此在肝疾病诊断中观察胶原纤维与网状纤维是相当重要的。最新的慢性肝炎的病理分类采用分级和分期即根据肝脏小叶内及汇管区炎症进行炎症活动度的分级(grade)，将炎症活动度分为轻、中、重。轻度(G1)：小叶内轻度炎症，汇管区无或轻度碎屑坏死;中度(G2)：小叶内炎症较重，出现桥接坏死或有十分显著的碎屑坏死;重度(G3)：桥接坏死范围广泛，出现多小叶坏死，小叶结构失常。根据肝组织内纤维化程度进行分期(stage),分为0期～4期(4期为肝硬化)，S1：汇管区扩大，有纤维组织增生;S2：汇管区纤维组织显著增生，并向小叶延伸，但小叶结构尚正常;S3：出现不完全性纤维间隔，小叶结构失常[3]。网状纤维是含有糖蛋白的胶原蛋白组成，易与氨性银结合，而胶原纤维分子中含有碱性氨基酸，而且胶原纤维结构疏松，能够与酸性染料结合;天狼猩红是一种很强的酸性染料，每个分子内含有6个磺酸基，它可以和胶原纤维分子碱性氨基酸反应，有较强的双折光现象，较好的提高Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原的分辨率，天狼猩红又是一种长形展开的分子，与胶原纤维吸附反应极稳定，故染色后不易褪色，具有较强的特异性。苦味酸天狼猩红在偏光显微镜下显示的胶原纤维的分型已得到证实，而且不像免疫组化的结果那样受很多因素的影响[1，4]。改良GordonSweets染色能同时显示网状纤维和胶原纤维的分布以及胶原纤维的增生情况，方法简捷、稳定、特异性强，在肝疾病诊断中可与免疫组化Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原抗体联合应用，为病理诊断提供了更可靠的依据。配制银铵液时所使用的玻璃器皿都必须干净，所用的蒸馏水要纯，加氢氧化铵要恰当，既不要过多，也不要过少，边加边摇动使沉淀物溶解至肉眼仅能见到一些微粒为止，配好后的银铵液很敏感，受光或空气作用后均易解离析出银盐，故宜用棕色玻璃瓶盛装并密封避光保存，一般置于冰箱可保存数天至数周，如见银盐析出则应重新配制;染色后，须及时用偏光镜进行观察，以便能观察到鲜艳的色彩。

　　【参考文献】

　　[1] 张晶，王泰玲，王明屹，等.免疫组织化学及特殊染色在显示肝脏细胞外间质成分中的作用[J].中华病理学杂志，1997，26：238.

　　[2] 杨光华.病理学[M].北京：人民卫生出版社，2002：204217.

　　[3] 周晓军，张泰和.病毒性肝炎和肝细胞癌的病理诊断进展与问题[J].中华病理学杂志，2000，29：245.

　　[4] 王伯沄，李玉松，黄高昇，等.病理学技术[M].人民卫生出版社，2000：143146.