抵抗素基因-420C＞G位点多态性与脑梗塞的相关性

　　作者：杨丽,吉中国　　作者单位：山东大学附属省立医院保健神经科， 济南 250021

　　【摘要】目的探讨抵抗素基因-420C>G位点多态性与脑梗塞及其相关临床指标的关系。方法 选取176例脑梗塞患者作为病例组，其中包括脑血栓形成组(94例)和脑栓塞组(82例)，选取140例健康查体者作为对照组。利用PCR限制性内切酶消化的方法检测抵抗素基因-420C>G位点的多态性，各组之间进行比较。结果 酶切后可见3种带型：CC型、CG型、GG型。脑血栓形成组等位基因频率及CC/(CG+GG)基因型分布与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，病例组中患冠心病的频率在基因型之间有显著不同(P<0.05)。结论 抵抗素基因-420C>G位点多态性影响动脉粥样硬化的形成，从而参与脑血栓形成及冠心病的发病。

　　【关键词】 抵抗素,多态性,脑梗塞,动脉粥样硬化

　　To investigate the correlation between the -420C>G polymorphism of the resistin gene and cerebral infarction. Methods The single nucleotide polymorphism (SNP) of resistin was demonstrated by means of PCR and digested by restriction endonucleases in 176 cases of cerebral infarction and 140 healthy controls. The study group was subdivided into two groups: the cerebral thrombosis group(94 cases) and the cerebral embolism group(82 cases). Results There were three genotypes at the site of -420 of resistin gene: CC, CG and GG. Also there were significant differences of the CC/(CG+GG) genotype(P=0.016?2) and the C/G allelic frequencies(P=0.014?3) between patients with cerebral thrombosis and healthy subjects. Subjects with cerebral infarction showed a significant association between cardiovascular diseases and SNP-420C>G(P=0.014). The CG+GG genotype had a high frequency. There were no associations between type 2 diabetes and insulin resistance or SNP-420C>G. Conclusion SNP-420C>G of the resistin gene may play a role in cerebral infarction and cardiovascular diseases probably by accelerating atherosclerosis.

　　Key words: Resistin; Polymorphism; Cerebral infarction; Atherosclerosis

　　抵抗素作为一种新发现的脂肪组织分泌的肽类激素，成为近年来的研究热点。它被认为在胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病及动脉粥样硬化中发挥重要作用。抵抗素基因-420C>G位点多态性可以影响启动子的活性，增加血液及组织中抵抗素的表达，从而影响其生物学效应。本文运用限制性内切酶方法，对抵抗素基因第-420C>G位点进行多态性分析，对脑梗塞与抵抗素基因多态性的关联，作一些初步探讨。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　选取近期在山东省立医院神经科住院的脑梗塞患者176例作为病例组。男112例，女64例，年龄43～86岁，平均(71.54±9.84)岁。其中脑血栓形成组94例，脑栓塞组82例，均符合全国第四次脑血管病会议《脑血管疾病分类(1995)》脑梗塞诊断要点，并经头颅电子计算机X射线断层扫描技术(computed tomography，CT)和/或颅脑核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)证实。同时选择年龄、性别匹配的健康体检者140例作为正常对照组。男88例，女52例，年龄43～78岁，平均(65.3±7.38)岁，均行CT或MRI检查排除脑卒中病史。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 观察指标测定

　　① 对全部受试者测定身高(cm)、体重(kg)、计算体重指数(BMI)=身高/体重2(cm/kg2);② 临床血液学指标测定:采用全自动生化仪检测空腹葡萄糖(FBG)、血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白A(ApoA)、载脂蛋白B(ApoB)及脂蛋白α(Lpα);采用化学发光法测定空腹胰岛素(FINS)水平。根据稳态模式评估法(homeostasis model assessment， HOMA)的HOMA胰岛素抵抗指数(HOMAIR)进行评价，即HOMAIR=(FBG×FINS)/22.5, HOMAIR的数值越大，表示个体的胰岛素抵抗程度越高。以该研究人群HOMAIR的第75位百分数(1.63)为诊断界点，即HOMAIR>1.63者为胰岛素抵抗，HOMAIR<1.63为非胰岛素抵抗。

　　1.2.2 -420C>G基因多态性检测

　　① DNA提取：以蛋白酶K消化蛋白、饱和酚-氯仿抽提法抽提基因组DNA用于分析抵抗素基因多态性;② 引物设计：应用primer5.0软件所设计的引物序列为:-420上游引物: 5′GTTTGCATCAGCCACCCT3′，下游引物5′GCACCGCAGCTCTTTCTT3′, 由上海生工生物有限公司合成及纯化;③ PCR扩增：50?uL反应体系中含DNA模板0.1?ng，dNTP各2.5?mmol/L，引物各20?umol，Taq DNA 聚合酶1.25?U，10×Buffer 5?uL。超纯水补足体积。先进行94?℃、10?min预变性后，进入PCR循环，参数为：94?℃ 30?s，57.3?℃ 30?s，72?℃ 1?min，共35个循环，72?℃ 10?min总延伸。PCR 完毕后，取5?uL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物。扩增产物长度为286?bp;④ 酶切过程：采用限制性内切酶Ear Ⅰ对PCR扩增产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS11.5版统计软件进行分析。以HardyWeinberg平衡检验基因型频数分布，确定研究样本的群体代表性(见表1)，计数资料以百分率(%)表示，组间变量比较用χ2检验，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 抵抗素基因-420C>G位点多态性分析

　　病例组及正常对照组PCR产物均可见预期的286?bp的片段。经Ear Ⅰ酶切后产物电泳共获得3种基因型，见图1：① CC型：缺乏Ear Ⅰ酶切位点，酶切后仅见与PCR产物一样的286?bp的片段;② GG型：含有Ear Ⅰ酶切位点，酶切后见179?bp和107?bp两条片段;③ CG型：杂和型，酶切后可见286?bp、179?bp和107?bp 3条片段。基因型及等位基因分布见表2。脑血栓形成组等位基因频率及CC/CG+GG基因型分布与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而脑栓塞组等位基因频率及CC/CG+GG基因型分布与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 病例组-420C>G基因型之间脑梗塞相关指标的比较

　　根据是否携带G等位基因，将病例组分为两亚组：CC组和CG+GG组。脑梗塞相关的临床指标已在表3中列出。经检验，年龄、舒张压、BMI、Glu、TG、TC、LDL、HDL、ApoA、ApoB、Lpα在两亚组之间差异均无统计学意义。糖尿病及胰岛素抵抗的频率与基因型分布亦无显著相关，而患冠心病的频率在两亚组之间有显著不同，CG+GG组明显高于CC组(P<0.05)。CC组的收缩压明显高于CG+GG组(P<0.05)，见表3。

　　3 讨 论

　　抵抗素又名脂肪组织特异分泌因子，由于最初被发现具有对抗胰岛素的作用，因此被称为抵抗素。人抵抗素基因定位于19p13.2,内含子边界序列均高度保守，其mRNA含476个碱基对,其编码区含有326个碱基对，编码108个氨基酸[2]。在啮齿类动物，抵抗素能够降低胰岛素的敏感性和葡萄糖耐量，从而被认为是连接肥胖和2型糖尿病的桥梁[3]。与啮齿类不同的是，人类的抵抗素主要由炎症细胞分泌，尤其是单核细胞和巨噬细胞，脂肪细胞几乎不分泌。抵抗素在人类和啮齿类中来源的不同预示着它的功能也不同。

　　抵抗素与人类2型糖尿病和肥胖的联系还不十分清楚。Lee等[4]认为血清抵抗素水平与2型糖尿病和肥胖均不相关;McTernan等[5]和Youn等[6]报道2型糖尿患者的抵抗素水平升高，但与肥胖不相关;Fujinami 等[7]和Azuma等[8]认为2型糖尿病患者和肥胖患者的抵抗素水平均升高。在遗传学上，已发现了抵抗素的多个多态性位点，如-420C>G，+299G>A,-638G>A, -537A>C等。其中-420C>G被认为是影响抵抗素基因表达的主要的[9]多态性位点。本研究结果显示，抵抗素基因-420C>G位点多态性与胰岛素抵抗和2型糖尿病无明显相关，与Kunnari等[10]的观点一致。Osawa[11]报道血清抵抗素水平在GG基因型表达最高，其次是CG型，CC型表达最少。在对韩国人[12]和日本人[13]的研究中这一观点也得到了证实。同时他们还发现，在单核细胞中抵抗素mRNA水平与-420基因型密切相关。

　　近年来的研究发现，抵抗素参与了炎症过程，并能活化血管内皮细胞，刺激平滑肌细胞的增值。这些均说明抵抗素在动脉粥样硬化中潜在的作用[14]。已有研究[15]在鼠和人的动脉粥样硬化斑块中找到了抵抗素mRNA及蛋白质的表达，并发现冠状动脉疾病患者的血清抵抗素水平增加。本研究结果显示，抵抗素-420C>G位点多态性与脑血栓形成和冠心病密切相关，而动脉粥样硬化斑块形成是上述两种疾病共同的基本的病理基础。因此，-420C>G影响脑血栓形成和冠心病发病的可能机制为：刺激蛋白1与含有-420C>G的DNA元件特异性地结合，增加了启动子的活性，促进抵抗素mRNA的表达，从而增加血清中的抵抗素水平。抵抗素通过激活核因子κB的信号传导途径加速促炎介质的的产生，如IL6、TNFα、IL12等，加剧炎症反应。而炎症反过来又可以促使抵抗素的表达，形成一个正反馈过程。同时，抵抗素能影响血管细胞的功能，活化内皮细胞，上调内皮素1、黏附分子及金属基质蛋白酶的表达，这些因子加剧了斑块的不稳定性，并且抵抗素还可以促进脂肪在巨噬细胞中积聚，上述机制共同促进了动脉粥样硬化的形成，成为脑血栓形成和冠心病的发病基础。脑栓塞组的基因型分布与正常对照组差异无统计学意义亦支持了上述观点。抵抗素-420C>G位点多态性对血压的影响鲜有报道，本研究结果表明，CC型收缩压显著高于CG+GG型(P<0.05),这一结果有待于以后更大样本量的进一步的研究加以证实。

　　总之，本研究认为，抵抗素基因-420C>G位点多态性影响动脉粥样硬化的形成，从而参与脑血栓形成和冠心病的发病，而该位点与胰岛素抵抗和2型糖尿病无明显相关。

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