黄芪注射液对脑出血大鼠细胞凋亡影响的研究

　　作者：许东,胡治平,秦毅,张华,赵海燕,文玉军　　作者单位：银川，宁夏回族自治区人民医院

　　【摘要】 目的 研究脑出血大鼠细胞凋亡的规律及黄芪注射液对出血后脑组织含水量和血肿周围区细胞凋亡的影响。方法 采用肝素化Ⅶ型胶原酶脑内注入法制作大鼠(160只)脑出血模型。制模后根据药物干预的时间随机分成4个治疗组(手术同时组，术后6 h组、12 h组、24 h组，每组32只)和出血对照组(共32只)。各治疗组每日经腹腔给予黄芪注射液1次，各组分别于第4 d及第7 d处死。再从上述5组中各选取12只大鼠用于脑组织含水量测定(干湿法)，观察不同时间开始治疗对大鼠脑组织含水量、血肿周围区细胞凋亡(脑组织切片TUNEL荧光染色)的影响。结果 治疗组[出血同时组(第4 d)、6 h组(第4 d、7 d)、12 h组(第4 d)]脑组织含水量较出血对照组明显减少(均P<0.01);脑出血后6 h血肿周围凋亡细胞开始出现，3 d达高峰，7 d后明显减少;各治疗组血肿周围细胞凋亡均明显降低，出血同时治疗组和6 h治疗组比24 h治疗组细胞凋亡率明显降低(均P<0.01);脑出血后存在血管内皮细胞凋亡。结论 脑出血后血肿周围神经细胞凋亡是脑出血后继发性神经损伤机制之一;黄芪注射液治疗脑出血，具有减轻脑水肿和神经细胞凋亡作用，以早期用药疗效更好。

　　【关键词】 脑出血,凋亡,黄芪注射液

　　Abstract：Objective To investigate the rule of cell apoptosis after intracerebral hemorrhage (ICH) in rats, and to analyze the effect of Astragalus injection on the brain tissue water content and cell apoptosis perihematoma.Methods Experimental ICH models of rats were produced in by injection of Collagenase into right caudate nucleus using stereotaxis technique. After operation, 160 SD rats were randomly divided into 4 test groups according to different intervention time (operation meanwhile group, 6 h group,12 h group and 24 h group after operation, 32 rats in each group) and hemorrhagic control group (32 rats). The rats in test groups were treated with Astragalus injection intraperitoneally once a day. All ICH animals were killed at 4 d or 7 d after ICH. 12 rats from the above each group were used to measure brain tissue water content (drywet method). The effect of different initiation time point of treatment on brain tissue water content and cell apoptosis perihematoma was observed. The apoptosis perihematoma was detected by TUNEL technique.Results Compared with hemorrhagic control group, brain tissue water contents improved significantly in operation meanwhile group (4 d), 6 h group (both 4 d and 7 d) and 12 h group (4 d)(all P<0.01). The cell apoptosis perihematoma after ICH operation appeared at 6 h, peaked at 3 d, and decreased gradually since 7 d. The TUNELpositive cells in the all test groups obviously decreased. The apoptosis rate in operation meanwhile group and 6 h group was significantly lower than in 24 h group (P<0.01).Cell apoptosis was also found in vascular endothelial cells after ICH.Conclusions Cell apoptosis is presented in the border zone of ICH and it is one of the factors that cause secondary brain injury following intracerebra1 hemorrhage. Astragalus injection can be used to treat ICH for antiapoptosis and should be used as early as possible.

　　Key words：intracerebral hemorrhage; apoptosis; Astragalus injection

　　研究[1]表明，细胞凋亡机制参与了脑出血后脑组织的损伤。脑出血后轻微脑缺血伴随着大量激活的细胞因子外渗所导致的细胞凋亡，是脑出血后细胞死亡的主要途径之一。近年来黄芪注射液被用于脑出血的治疗，疗效确切。但其是否干预脑出血后细胞凋亡机制，目前尚不清楚。为此,本研究以实验性脑出血模型大鼠为研究对象，以血肿周围区细胞凋亡率及脑含水量等作为观察指标，观察黄芪注射液干预对出血性脑卒中的作用，探讨其可能的作用机制，以寻找其治疗脑出血的最佳治疗时间窗。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 健康SD大鼠,雌雄不限，共160只;质量300～350 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号(医动字 第 08005号)。

　　1.1.2 试剂与仪器 (1)试剂:原位末端标记(TUNEL)荧光检测系统(Promega公司)，Ⅶ型胶原酶(Sigma公司)，其他为国产分析纯。黄芪注射液(哈尔滨圣泰制药有限公司, 批号20050203)。(2)仪器:脑立体定位仪(NARISHIGE SN3型)，冰冻切片机(LEICA CM1800型)，荧光显微镜(Olympas BH2型)，电子精密天平(上海天平仪器厂)，Olympas光学显微镜，微量注射器(上海医用激光仪器厂)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脑出血大鼠模型制作 采用胶原酶脑内注入法建立脑出血模型。动物称重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)。麻醉成功后，将大鼠固定于脑立体定位仪，在脑立体定位仪引导下用微量进样器向尾状核(以前囟为原点R 3.0㎜，A 0.2 ㎜，H 5.0㎜)注入浓度为1.0 μg /μl的Ⅶ型肝素化胶原酶0.25 μl。

　　1.2.2 分组 将制模成功的大鼠随机分成治疗组(手术同时治疗组、术后6 h、12 h和24 h治疗组,每组32只)和出血对照组(32只)。各治疗组按术后相应时间点予腹腔注射黄芪注射液[8 ml/(kg•d)(1 ml=2 g原药材)]，每日注射1次至处死日。出血对照组不予治疗。

　　1.2.3 脑含水量的测定 用干湿法测定脑组织含水量[2]。从上述5组实验大鼠中各选取12只用于脑含水量测定，每组再分为第4 d和第7 d组，各6只，分别于第4 d、第7 d进行神经功能评分后过量麻醉断头处死，迅速取脑，将取出的脑组织放在一个内有生理盐水湿润的定性滤纸的培养皿中，以防水分蒸发。去除皮质表面的软脑膜和凝血块，从开颅取脑到称重完毕控制在5 min内，称取湿重后放入电热恒温箱内100℃烘烤48 h，至恒重后用电子天平称干重。脑含水量=(湿重-干重)/ 湿重×100% 。

　　1.2.4 光镜检查 术后第4 d、第7 d用4%多聚甲醛主动脉内灌流固定，取出脑组织于30%蔗糖磷酸盐缓冲液脱水后，于冰冻切片机行冠状切片(片厚30 μm)。将冰冻切片按照常规步骤进行HE染色，镜下观察。并进一步观察出血后6 h、24 h以及术后第4 d、第7 d时间点的病理变化情况。

　　1.2.5 凋亡细胞的检测 各组术后第4 d和第7 d随机取10只大鼠，麻醉后处死，制作脑冰冻切片。冰冻切片入PBS 5 min，4%多聚甲醛的PBS液 15 min ，PBS液 5 min 两次，小心擦去组织周围多余水分，每张切片加20 μg /ml蛋白酶K 100 μl室温孵育8～10 min 。PBS室温5 min， 4%多聚甲醛PBS 5 min， PBS室温5 min，用滤纸去除切片组织周围多余水分，加100 μl平衡buffer覆盖组织，室温下平衡5～10 min。当组织在平衡时，在冰上解冻 Nucleotide Mix，制备rTdT buffer。如下(每张切片用量):平衡buffer 45 μl ，Necleotide Mix 5 μl，rTdT酶1 μl。阴性对照:用1 μl蒸馏水代替rTdT酶。用滤纸吸干组织周围区域，加入50 μl rTdT buffer。在湿盒内37℃孵育60 min，充分反应。以下步骤注意避光进行。放入2×SSC液中15 min，终止反应。PBS液 室温5 min×3次。碘化丙啶(Propidium iodide solution)1 μg/ml，室温15 min。蒸馏水5 min×3次。立刻在暗室内荧光显微镜下观片、拍照。在200倍视野下，随机观察并计数血肿周围3个不重复视野的TUNEL阳性细胞数，并记录。

　　1.2.6 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行分析，结果数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠脑组织含水量比较 见表1。各治疗组大鼠脑组织含水量较出血对照组减少，其中以出血同时治疗组、6 h治疗组和12 h治疗组在第4 d时，及6 h治疗组在第7 d时与出血对照组比较差异有统计学意义(均P﹤0.01)。表1 各组脑含水量的比较 注：与出血对照组比较*P<0.01

　　2.2 脑出血后血肿及其周边病理形态学变化 HE染色光镜观察显示:脑出血后6 h，出血灶中心以大量红细胞为主，血肿周围区呈局部缺血性改变，神经细胞肿胀，组织结构紊乱。24 h后，出血灶处红细胞形态完整，边缘可见核碎裂，血肿边缘区无明显炎性细胞浸润，中线向对侧偏移，血肿侧侧脑室被挤压变小，血肿周围神经细胞减少，大部分区域呈现无结构红色淡染。在血肿边缘区域，部分细胞核染色质浓缩成团块，有的细胞仅有浓染的染色质片段，染色质周围未见胞浆。对照组出血4 d后，血肿边缘区可见大量中性粒细胞浸润，周围区见大量小胶质细胞被激活，并见吞噬红细胞等血肿成分，脑水肿明显，中线向对侧移位(见图1、2、3)。出血7 d后，中心区可见大量含铁血红素的吞噬细胞，仍有胶质细胞增生。血肿周围区可见少许新生毛细血管，其内皮细胞肥大;中心区星形细胞增生肥大。

　　2.3 细胞凋亡情况 TUNEL荧光染色阳性细胞见核周染色质浓缩呈明亮点状的黄绿色细胞(见图4)。TUNEL荧光染色阳性细胞主要分布于两个区域:出血灶周围及出血灶同侧大脑皮质。脑出血后6 h在出血灶周围和同侧大脑皮质出现凋亡细胞，脑出血后24 h凋亡细胞数明显增多，4 d后开始逐渐减少。脑出血后4 d出现典型凋亡细胞的特征，如新月形、马蹄形，并可见核碎片聚集的凋亡小体以及染色质边集现象。7 d时仍可以看到明显的血管内皮细胞凋亡。脑出血各组、各时间点凋亡细胞数比较见表2。各治疗组TUNEL阳性细胞数与出血对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。在第4 d和第7 d时间点上，出血同时治疗组和6 h组均比24 h治疗组凋亡细胞数明显降低(P<0.01)。

　　图1 出血对照组血肿边缘区被激活的小胶质细胞,并见吞噬红细胞(HE×400) 图2 出血对照组4 d尾状核区出血(冠状切面)，脑水肿明显、中线向对侧偏移(HE×400) 图3 对照组出血4 d后，血肿周围区仍可见大量活化的胶质细胞(HE×200) 表2 脑出血大鼠血肿周围区TUNEL阳性细胞数比较 注：与出血对照组比较*P<0.01;与出血同时治疗组和6 h治疗组比较△P<0.01

　　3 讨 论

　　脑出血后血肿在其周围区域除了占位效应，还引发3种病理变化:即神经细胞和胶质细胞死亡，细胞毒性和血管源性脑水肿以及继发性缺血、缺氧。细胞死亡的主要方式有坏死和凋亡;坏死是具有细胞肿胀、溶解特点的细胞死亡，凋亡涉及单个细胞皱缩和凋亡小体形成，随后被邻近细胞吞噬[3]。已有研究[4，5]表明细胞调亡是脑出血后血肿周围区细胞死亡的主要形式。脑出血发生后，一般在2～3 h之内出现继发性缺血，血肿周围组织中毛细血管由于持续缺血、管壁受损、红细胞渗出，致血管周围出血区、血肿周围脑组织神经细胞受损。进一步研究[6，7]证实，血肿周围缺血区脑组织面积是血肿本身面积的数倍，严重的脑水肿危及脑微循环并加重缺血过程、阻碍血流恢复，神经机能的损害可能主要是由于这种继发性脑缺血所致。因此，对缺血脑组织进行及时有效的保护、减轻不可逆损害是改善脑出血愈后的重点课题。黄芪含有丰富氨基酸，微量元素及黄芪皂甙类和黄芪多糖等多种成分。现代药理研究[7]报道黄芪有多方面的药理作用，具有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、降低血脂和改善微循环等作用。另据报道[8]黄芪对心功能具有显著的改善作用,对异常的血液流变学指标亦有改善作用。周海燕等[9]进一步实验证实，黄芪具有一定的抗神经细胞缺氧损伤作用。本研究显示实验性脑出血后凋亡细胞在早期即开始出现，使用黄芪注射液治疗后有效降低了血肿周围区细胞凋亡率及脑组织含水量，早期用药效果较为明显。

　　本实验发现大鼠脑出血后6 h和12 h治疗组脑组织含水量降低最明显，与出血对照组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。目前研究[10,11]认为脑出血后脑水肿主要有两方面因素:(1)脑组织缺血缺氧，线粒体、内质网等细胞器功能受损，ATP迅速耗竭，ATP依赖的离子泵衰竭，细胞内外正常离子梯度消失，K+ 外流，Na+、Ca2+内流，引起细胞内水肿;(2)颅内血肿中的凝血酶与胶原酶等生化活性物质破坏血脑屏障，血浆进入脑内，引起血管源性脑水肿。黄芪注射液减轻脑出血后脑水肿的主要作用机制是:在脑水肿高峰到来之前改变血液流变学、稳定血管内皮细胞膜、保护血脑屏障，从而减轻血管源性脑水肿;改善微循环、降低细胞缺血缺氧性损伤，从而减轻细胞内水肿。

　　细胞凋亡是一个高度有序的受基因调控的DNA有控制降解的主动过程，此过程需要基因的活化及蛋白质的合成，并受到多途径、多分子的精确调节。细胞凋亡过程大致可分为启动阶段和执行阶段。在启动阶段细胞感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关开启或关闭，从而引起不同信号转导途径，此阶段为多种蛋白表达和分子合成阶段，通过干预相关蛋白的表达和分子合成可阻止凋亡的发生。凋亡一旦进入执行阶段则细胞必然死亡。本研究发现凋亡细胞在脑出血后6 h开始出现，并渐达高峰，4 d开始逐渐减少。各治疗组细胞凋亡数与出血对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)，出血同时治疗组和6 h组均比24 h治疗组凋亡细胞明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。因此，抗凋亡措施应在细胞损伤早期及凋亡早期阶段进行。黄芪注射液在早期可通过抗脂质过氧化、降低自由基生成、增加自由基清除、抗氧化及稳定细胞膜[12]，增加组织细胞抗缺血缺氧能力，从而达到抗凋亡作用。黄芪注射液成份复杂，具有多种药理作用，是否还通过干预细胞凋亡的信号通路达到抗凋亡作用，本实验还无法解释，尚有待进一步研究。

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