黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

　　作者：王新生 崔慧先 李志鹏 薄爱华 作者单位：河北医科大学解剖教研室，河北 石家庄 050017

　　【摘要】 目的 观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的特点。方法 使用稀释浓度为200 mg/ml的黄芪注射液诱导BMSCs，分别在1、3、6 d倒置显微镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法观察巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)的表达。结果 诱导后可见细胞形态发生改变，自胞体长出突起，随诱导时间延长，长出突起的细胞数量增多，突起进一步伸长，部分突起末端呈分叉状，可见网络状连接。免疫细胞化学示：nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞在诱导第3天较多，MAP2阳性细胞在第6天较多。结论 黄芪首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并促进已分化的细胞进一步成熟、老化。

　　【关键词】 黄芪,骨髓间充质干细胞,神经干细胞

　　骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是较早被认识的成体干细胞(adult stem cells)之一，具有多向分化潜能，可以向骨、软骨、脂肪细胞、肝细胞、内皮细胞以及神经元样细胞分化，使其成为最易获得的可向3个胚层分化的成体干细胞之一，其多向分化潜能可与胚胎干细胞相媲美〔1，2〕。近年来中药制剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞取得了很大进展〔3〕。为积累实验资料和拓宽中药及其制剂的应用，我们对黄芪注射液诱导BMSCs分化的特点进行了观察，以期为中药辅助干细胞移植治疗帕金森病和老年痴呆症等老年性神经退化性疾病的研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 6 w龄清洁级Wistar雄性大鼠1只，体重200 g，购自中国医科院实验动物中心。

　　1.2 主要试剂 LDMEM(Gibco)，胎牛血清(天津市川贝生化制品有限公司出品,批号：060406);黄芪注射液(大理药业有限公司，批号：060105);兔抗巢蛋白(nestin)，兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)，小鼠抗微管相关蛋白2(MAP2)，兔抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，SABC试剂盒，DAB试剂盒均购自武汉博士德公司。

　　1.3 BMSCs的分离、纯化 1%戊巴比妥钠1 ml/100 g腹腔注射麻醉，无菌状态下分离大鼠的股骨和胫骨，剪开两端，用DHanks液冲洗骨髓腔，转入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养基(15%胎牛血清+LDMEM)重悬浮，调整细胞浓度为1×106/ml的密度，接种于50 ml培养瓶中，培养1 d后，更换培养基，弃掉未贴壁的细胞。以后每隔1～2 d进行半量或全量换液。细胞达到80%～90%融合后用消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)消化重悬细胞，以1∶3传代，至第3代细胞冻存备用。

　　1.4 BMSCs向神经元样细胞的诱导 取第4代的BMSCs，以4×105/ml的浓度接种于放置有盖玻片的12孔板内，培养液为含15%胎牛血清的LDMEM，置于37℃、5%CO2培养箱内培养制备细胞爬片。盖玻片上细胞达到80%～90%融合后,全量换液,加入诱导培养基(诱导培养基为：200 mg/ml黄芪注射液+LDMEM+15%胎牛血清)诱导，对照组不加黄芪注射液。诱导时间分为：1、3、6 d。

　　1.5 BMSCs的诱导鉴定 采用免疫细胞化学方法观察nestin、NSE、 MAP2、GFAP等特异性标志物的表达。对照组设阴性对照和阳性对照，阴性对照用PBS液代替一抗，阳性对照采用正常大鼠脑切片免疫组化结果。免疫细胞化学步骤为：细胞爬片用4%多聚甲醛固定20 min;山羊血清封闭5 min;加入一抗,4℃过夜;加入生物素标记的二抗,室温20 min;再加入链霉亲和素复合体,室温孵育20 min;DAB显色，中性树胶封片。以细胞内出现棕黄色颗粒状着色为阳性，未着色为阴性。在每个实验组中，随机选取6个视野，计数6个视野中阳性细胞总数和总细胞数，以公式：阳性率=(阳性细胞数/总细胞数)×100%计算阳性细胞率。

　　1.6 统计方法 使用SAS6.01软件，采用Calculate tests of noassociation(计算没有关联的检验)，进行多个样本率的比较。

　　2 结果

　　2.1 体外培养的BMSCs的形态学特点 在倒置显微镜下可见，经分离培养得到的原代细胞多为圆形有核细胞，扩增传至第4代后，细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状。加入200 mg/ml黄芪注射液进行诱导，1 d后，可见部分细胞形态发生改变，自胞体长出突起;3 d后可见较多细胞长出突起，各个细胞突出数量不一，形态似神经元样细胞;6 d后可见突起进一步伸长，部分突起末端呈分叉状，细胞间借突起相连，但培养液中可见少量漂浮细胞，说明有少量细胞可能出现老化死亡(图1)。

　　2.2 免疫细胞化学染色结果 在黄芪诱导1、3和6 d时，均可见nestin、NSE、MAP2、GFAP 4种抗体阳性染色的细胞(图2)。其阳性细胞率(%)的统计结果见表1。

　　图1 倒置相差显微镜观察细胞形态变化特点(×100)(略)

　　图2 光镜观察免疫细胞化学染色阳性细胞 (×100)(略)

　　表1 四种抗体阳性细胞率(%)的变化(略)

　　与1 d相比较：1)P<0.000 1

　　表1表明，nestin，NSE,GFAP 3种阳性细胞表达率在诱导3和6 d后无显著性差异，但明显高于诱导1 d的表达率(P<0.000 1)。而MAP2阳性细胞表达率在诱导1和3 d无显著性差异，但在诱导6 d后，表达率显著提高(P<0.000 1)。

　　3 讨论

　　现代中药学研究表明黄芪主要化学成分为黄芪苷类、多糖类、黄酮类、氨基酸、微量元素、胆碱、叶酸等。黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基等作用，有望在神经系统损伤修复上发挥作用〔4〕。余勤〔5〕、王勇〔6〕等先后对黄芪诱导BMSCs分化为神经元样细胞进行了观察，但结果有所差异，余勤的实验结果中无GFAP阳性细胞，王勇的实验结果中有GFAP阳性细胞出现。为进一步探讨黄芪注射液的作用特点，我们使用200 mg/ml黄芪注射液的培养基进行诱导实验，结果表明，随诱导时间的延长，细胞突起进一步伸长和出现末端分叉现象，表现为神经元样细胞的形态，同时可见培养液中出现少量悬浮细胞，说明黄芪可促进细胞突起的生长，但随着作用时间的延长，一方面可以促进细胞成熟，同时又加速细胞的老化死亡。而免疫组化的结果表明，黄芪可能首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并进一步促进已分化的细胞成熟、老化。

　　综上分析，黄芪具有诱导BMSCs向神经元前体细胞分化的作用，并且可以进一步促进其向成熟神经细胞分化，并且由于其可促进细胞突起的生长，对神经细胞有营养、保护作用〔7，8〕，所以临床应用价值和可行性获得了极大的提高，但其如何提高定向分化率，如何应用于临床，如何发挥其在干细胞治疗神经系统疾病的过程中的作用，还需深入的研究。

　　【参考文献】

　　1 Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow〔J〕.Nature,2002;418(6893):419.

　　2 Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop D,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons〔J〕.J Neurosci Res，2000;61(4):36470.

　　3 徐志伟，张 进，丁富平.中医药在干细胞移植治疗中的干预作用研究述评〔J〕.广州中医药大学学报，2006;23(1)：14.

　　4 冯 晨，唐锁勤.黄芪药理作用及其在儿科中的应用〔J〕.中国药物应用与监测，2006;3(1)：4851.

　　5 余 勤，罗 依，董 勤，等.黄芪对间质干细胞分化为神经元样细胞的定向诱导作用〔J〕.中华急诊医学杂志，2004;13(12)：82630.

　　6 王 勇，陆长青，王 凡.黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究〔J〕.四川解剖学杂志，2006;14(1)：58.

　　7 姚晨玲，黄培志，童朝阳，等.黄芪注射液对培养神经细胞损伤的保护作用〔J〕.中国临床医学，2002;9(2)：1645.

　　8 赵燕玲，曲友直，王宗仁.黄芪对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响〔J〕.中国中西医结合急救杂志，2005;12(6)：341