肝癌切除术并肝动脉结扎和门静脉化疗对复发肝癌表达MDR1和MRP的影响及意义

作者：李幼林,易继林

 作者单位：1.温州市第三人民医院 普外科， 浙江 温州 325000； 2.华中科技大学同济医院 普外科，湖北 武汉 430022 
       【摘要】  　　目的 探讨肝癌切除并肝动脉结扎和门静脉化疗对复发肝癌多药耐药（multi drug resistance-1，MDR-1）和多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein-1，MRP-1）表达的影响。方法 应用免疫组化SABC法对23例复发的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC)手术切除的石腊包埋标本切片进行P-gp和MRP-1的蛋白表达测定，以自身原发灶作为对照进行统计学分析。结果 P-gp在HCC复发前后的阳性表达率分别为65.2%和52.2%（P>0.05），MRP-1在HCC复发前后的阳性表达率分别为34.8%和69.6%（P<0.05)。结论 肝癌切除并肝动脉结扎和门静脉定期化疗后复发肝癌MDR-1的表达受到抑制。

    【关键词】  原发性肝肿瘤；多药耐药；P-糖蛋白；多药耐药相关蛋白；肝动脉结扎；门静脉化疗

　　 Influence of hepatectomy combined with hepaticer artery ligation and portal vein chemotherapy for hepatocellular carcinoma on the expression of MDR-1 and MRP and significance    LI Youlin*， YI Jilin.  * Department of general surgery， the Third People's Hospital of Wenzhou， Wenzhou 325000

    Abstact  Objecive  To explore and discuss the influence of hepatectomy combined with hepatic artery ligation and portal vein chemotherapy for hepatocellular carcinoma on the expression of MDR-1 and MRP-1. Methods  The expression of P-gp and MRP-1 in 23 specimen of recurrent HCC patients was determined with immunohistochemical method. The primary tumor tissues served as a control group and analyzed statistically. Results The positive rate of P-gp expression in HCC was 65.2% before recurrence and 52.2% after recurrence(P>0.05)， while that of MRP-1 expression was 34.8%　and 69.5%， respectively　(P<0.05). Conclusion The expression of MDR-1 of the recurrent hepatocellular carcinoma is inhibited after hepatectomy combined with hepatic artery ligation and portal vein chemotherapy for hepatocellular carcinoma.

    Keywords  primary liver neoplasms； multidrug　resistance； P-glycoprotein； multidrug resistance-associated protein；hepatic artery ligation; portal vein chemotherapy随着非P-gp介导多药耐药机制及其逆转剂的深入研究，发现其相关的基因表达和蛋白质功能处于有序的动态变化过程，但鲜有关于肝癌切除并肝动脉结扎和门静脉置泵化疗对复发肝癌多药耐药相关的基因表达产物的影响方面的报道。我们以23例原发性肝癌切除并肝动脉结扎和门静脉置泵定期化疗后2年内复发的病例作为研究对象，选取膜转运蛋白机制中具有代表性的P-糖蛋白(pglycoprotein，P-gp)和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein-1，MRP-1)为检测指标，采用免疫组化SABC法测定P-gp和MRP-1在同一肝癌患者原发灶和复发灶中的表达，探讨肝癌切除并肝动脉结扎和门静脉置泵化疗对复发肝癌表达MDR-1和MRP-1的影响及临床意义。

    1  资料和方法

    1.1  一般资料  筛选1996～1999年同济医院23例原发性肝癌切除并肝固有动脉结扎和门静脉置泵化疗后2年内复发再切除的二次肝癌石蜡包埋标本，且经病理证实均为肝细胞癌，以第1次切除的肝癌原发灶作自身对照。门静脉置泵化疗采用AMF方案（阿霉素+丝裂霉素+5-FU）每月1次。

    1.2  试剂和方法  小鼠抗人P-gp单克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德生物试剂有限公司，免疫组化按SABC试剂盒指导步骤进行染色。

    1.3  结果判断　 P-gp定位于细胞膜和细胞浆，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照，胞浆和（或）胞膜呈棕黄色染色为阳性；MRP-1表达产物以胞浆为主，胞膜少见，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知胆管癌阳性片作对照。

    １.４  统计学方法  采用?字2检验分析，P＜0.05有统计学意义。

    2  结果

    2.1 P-gp在原发灶和复发灶中的表达  P-gp染色位于肝癌细胞膜和细胞浆，呈均匀或散在棕色颗粒。23例患者中原发肝癌组织P-gp染色阳性15例，阳性率为65.2%，复发肝癌组织P-gp染色阳性12例，阳性率为52.2%，见表1。

    2.2  MPP-1在原发灶和复发灶中的表达  MRP-1染色位于以胞浆为主，胞膜少有，呈均匀或散在棕色颗粒。23 例患者中原发肝癌组织MRP-1染色阳性8例，阳性率为34.8%；复发肝癌组织MRP-1染色阳性16例，阳性率为69.6%，见表2。

    3  讨论

    全身化疗治疗肝癌的有效率多不超过15%，且毒副反应大，一般不单独使用。局部化疗虽其有效率稍有提高且毒副反应小，但在预防复发和延长生存期方面改善不明显。为预防肝癌复发，常用的方法有：肝动脉插管栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、门静脉化疗（port vein chemotherapy，PVC）、肝动脉化疗（hepatic artery  chemotherapy，HAI）、肝动脉结扎（hepatic artery ligation，HAL）等。 

    徐克成[1]报道109例肝癌根治术后随访2月，发现41例有残癌（占37.6%），香港大学玛丽医院为降低复发率较早采用HAL+PVC，认为阻断肝动脉供血后使残癌生长受抑制，更有利于PVC发挥作用。HAL后虽有膈下动脉等来源的侧支血管开通[2]，但自由门静脉压力（free portal vein pressure，FPP）动态观察[3]显示门静脉血流量长时间增加，提示侧支开通的动脉供血量明显少于术前肝动脉的供血量，且供血的区域不同，故而残癌的生长环境发生改变，其MDR生物学特性亦可能发生相应变化。

  P-gp是MDR-1基因的表达产物，是许多恶性肿瘤多药耐药的经典途径，MRP-1和P-gp同属细胞膜ATP结合蛋白，为能量依赖型药泵，可将细胞内多种MDR相关药物泵出胞外，导致肿瘤细胞内化疗药物蓄积浓度降低而不能有效杀死肿瘤细胞，不过它们转运的底物有所不同。

    本研究23例复发后再次切除的肝癌组织表达P-gp和MRP-1阳性率分别是52.2%和69.6%，第1次切除的肝癌组织表达P-gp和MRP-1阳性率分别是65.2%和34.8%。通过对比，我们发现复发后的肝癌组织表达MRP-1的阳性率明显增高（69.6%vs 34.8%），而表达P-gp阳性率略有减少（52.2%vs 65.2%）。关于肝癌切除并HAL+PVC后复发出现肝癌细胞表达P-gp和MRP-1的变化，目前尚无同类报道。翟宝进等[4]报道以阿霉素建立的HepG2/Adm人肝癌耐药细胞的P-gp表达均有上调，朱虹等[5]报道使HepG2肝癌细胞分别在低氧、低糖的微环境下生长，发现低氧时MRP-1mRNA 升高明显，肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein，LRP)和 P-gp次之，提示MRP-1的表达上调，HAL与PVC有协同作用，依此推测门静脉置泵化疗后复发的肝癌细胞表达P-gp和MRP-1均应上调。我们的实验显示MRP-1的表达确实明显上调，提示与肝癌的复发有关，但P-gp 的表达稍降。

    此现象是否提示肝动脉结扎后复发肝癌细胞P-gp的表达受到抑制? 国内外有大量研究报道肝癌化疗后P-gp的表达增高的文献，肖恩华等[6]报道经肝动脉单纯灌注化疗后肝癌细胞表达P-gp的阳性率接近100%；其后，肖恩华等[6]又比较不同的介入方式对肝癌P-gp表达的影响，发现碘油、乙醇、抗癌药加明胶绵行肝动脉栓塞化疗可明显降低Ⅱ期切除的肝癌细胞的P-gp表达阳性率，仅为18.2%，认为多材料栓塞可克服HCC细胞的耐药性而优于单一材料栓塞或单纯灌注化疗，分析与肝癌细胞缺血、低氧的微环境改变有关，其间似有关联。

    进一步推测，HAL+PVC影响了MDR-1基因的表达，是否有其他更多相关基因的表达也受到影响？HAL+PVC具有化疗反应轻、给药方便、肝功能储备损害小、与TACE比引起肝内或远处转移少，深入研究HAL+PVC后复发肝癌发生的生物学特征变化，对降低肝癌的复发率无疑会有促进作用；另一方面，复发的癌巢中存在低表达或不表达P-gp和MRP-1的肝癌细胞，预示有其他耐药机制诸如许多文献报道的GST-π（glutathione S-transferase）、Topo-Ⅱ（Topoisomerase Ⅱ）、PKC（protein kinase C）、DNA修复或细胞凋亡相关基因及与肝细胞解毒转化相关的不明机制等）的存在，甚至可能比P-gp和MRP-1等膜转运蛋白机制更重要。因此，应进一步探索针对多种MDR机制多样化疗方案的序贯疗法以预防复发。

    由于随后对AMF方案及给药方式进行调整，肝癌复发率有所降低，致本研究可选择的例数较少，且缺少复发肝癌动脉血供的TACE或PET-CT等影像学资料。因为HAL疗效的短时效性和减少肝功能储备以及影响肝癌复发后超选择性介入栓塞治疗径路，现在HAL的临床意义非常有限，但本课题的回顾性研究为HAL+PVC对P-gp和MRP-1表达的影响提供了多药耐药新的线索。

【参考文献】
  [1] 徐克成. 原发性肝细胞癌复发及其预防[J]. 中国交通医学杂志，2006，20（1）：4-7.

[2] 张帆，佟小强，邹英华. 经膈下动脉介入治疗原发性肝癌安全性[J]. 中国介入影像与治疗学，2006，3（6）：472-474.

[3] 王在国，丁福全，张爱玲，等. 肝癌不同治疗方法对门静脉压力的影响[J]. 肝胆胰外科杂志，2000，12（4）：176-177.

[4] 翟宝进，伍烽，邵泽勇，等. 阿霉素诱导人肝癌细胞多药耐药株的建立及其生物学特性评性[J].癌症，2004，23（4）391-395.

[5] 朱虹，陈孝平，罗顺峰，等. 微环境诱导肝细胞癌多药耐药的形成及机制[J]. 中华实验外科杂志，2005，22（11）：1315-1318.

[6] 肖恩华，胡国栋，刘鹏程，等. 介入治疗对肝细胞癌耐药基因表达的影响[J]. 中华放射学杂志，1999，33（3）：150-152.